撰文 | 珊今
責編 | 雪月
漫漫人類抗疫史，在疫苗出現之前，一次疫病的爆發就往往意味著大規模的人口銳減。而疫苗的出現使得一大批瘟神偃旗息鼓，灰頭土臉逃出歷史長河。2019-nCoV出現之後，科學家們對於其疫苗的研發也在緊鑼密鼓的進行中。負責免疫的T細胞以及B細胞對於抗原的識別都依賴於抗原的抗原表位（Epitopes），因此對於2019-nCoV潛在的T細胞與B細胞的抗原表位進行研究，無疑將為開發更有效的疫苗並鑑定中和抗體（Neutralizing antibodies）提供有力的理論支撐。
2020年2月21日，史丹福大學Ethan Fast和陳濱濱在預印版平臺bioRxiv發表文章Potential T-cell and B-cell Epitopes of 2019-nCoV，對2019-nCoV潛在的T細胞與B細胞抗原表位進行了深入的探討。作者結合結構生物學和機器學習的計算工具，基於病毒蛋白抗原呈遞和抗體結合特性來識別2019-nCoV的T細胞和B細胞的抗原表位，並用SARS-CoV的實驗數據驗證了計算的有效性。他們鑑定出了405個病毒肽，它們對於人類MHC-I和MHC-II等位基因具有良好抗原呈遞分數；以及2019-nCoV刺突蛋白受體（Spike Protein Receptor）結合結構域附近的兩個潛在的中和B細胞表位（440-460和494-506）。他們分析了來自四大洲的68個病毒基因組的突變譜，並確定了96處突變，而這些突變更多地出現在具有良好MHC-I抗原呈遞分數的區域，刺突蛋白受體結合域附近沒有突變存在。
在2019-nCoV中識別T細胞和B細胞表位的計算流程
冠狀病毒在2002年SARS爆發之後被人熟知，這類正義單鏈RNA病毒至今仍時不時肆虐，如眼下的2019-nCoV，再如前幾年的MERS。人們期盼著能有冠狀病毒的疫苗被開發出來造福大眾，然而，迄今為止還沒有任何一種冠狀病毒的疫苗通過臨床試驗，無論是人類還是其他動物中的試驗。在動物模型中，滅活的全病毒疫苗由於缺乏集中的抗原表位而不能提供完全的保護。SARS-CoV和MERS-CoV的疫苗也導致小鼠過敏和免疫病理反應。冠狀病毒株之間的多樣性為我們提出了另一個挑戰，因為在冠狀病毒屬中至少有6個不同的亞組（Subgroup）。儘管SARS-CoV和2019-nCoV處在相同的亞組，但它們的基因組只有77％相同。了解2019-nCoV的共有和獨特表位將有助於為患者設計更好的疫苗或診斷性臨床試驗（Diagnostic tests）。
中和抗體可以完全阻止病毒進入人體細胞。2019-nCoV有著已知的受體ACE2（Angiotensin-Converting Enzyme 2），破壞了其與ACE2的結合，2019-nCoV就無法侵入人體。於是探究2019-CoV與ACE2結合的位點處是否存在可能的抗體結合位點（B細胞抗原表位）就有了重大的現實意義。除中和抗體外，人體還依賴於細胞毒性CD8 T細胞和輔助CD4 T細胞來完全清除病毒。人類MHC-I（Major Histocompatibility Complex）與MHC-II複合體對於病毒肽段的呈遞在抗病毒T細胞反應中起著至關重要的作用。與B細胞抗原表位不同，T細胞抗原表位可以位於病毒蛋白中的任何位置，因此對於T細胞抗原表位的研究，要貫穿全部病毒蛋白。
2019-nCoV有4種主要結構蛋白，即S（Spike）、M（Membrane）、E（Envelope）和 N（Nucleocapsid），以及至少6個其他開放閱讀框(ORFs)。所有的蛋白質片段均有可能由MHC-I或MHC-II呈遞並被T細胞識別。作者應用NetMHCpan4和MARIA兩種人工神經網絡算法進行預測抗原表達和識別潛在的T細胞表位。模型顯示ORF1AB，S，E蛋白存在著大量可以被MHC-I和MHC-II良好呈遞的肽段，這就為將來的疫苗開發提供了一個候選池。而在中國人群中常見的MHC等位基因中，HLA-C基因有著更廣泛的抗原表位呈遞能力，提示我們未來基於抗原表位的疫苗研發應該包括與HLA-C 相關的抗原表位。隨後作者利用SARS-CoV的實驗數據驗證了整個策略的有效性。
預測2019-nCoV spike (S)蛋白上的B細胞表位
人體的免疫選擇壓力已經被證明可以驅動病毒突變從而逃避免疫監視。作者猜想2019-nCoV也發生了類似的突變。研究人員整理了來自四大洲的68個病毒基因組，與已發表的參考基因組相比，確定了93個點突變，2個無義突變和1個缺失突變。這些突變更多地出現在具有良好MHC-I抗原呈遞分數的區域，刺突蛋白受體結合域附近沒有突變存在。目前仍需要患者的MHC等位基因信息和T細胞分析來更好地評估這一現象，但是患者通常攜帶少於3個突變，因此，針對多個表位的疫苗不會因為如此少量的突變而無效。
S蛋白是2019-nCoV表面表達的主要跨膜糖蛋白，負責受體結合和病毒體進入細胞。毫無疑問它是人類中和抗體的最可能靶標。通過與SARS-CoV的S蛋白(PDB: 6ACC)的同源建模，研究者獲得了2019-nCoV的s蛋白的可能3D結構。對於2019-nCoV S蛋白，研究者利用Discotope2在S蛋白上的 RBD（Receptor binding domain）上發現了類似於SARS-CoV的S蛋白的抗體結合位點。通過計算的方法，研究者預測了2019-nCoV的S蛋白與人類ACE2受體之間一個潛在的相互作用構像。主要的抗體結合位點與ACE2與S蛋白結合的相互作用表面基本重疊，所以與該表面結合的抗體可能會阻止病毒進入細胞。此外，Discotope2鑑定出541-555 AA為另一個結合位點，這點得到了最近兩項獨立研究的支持。
理想的抗原應由一般人群中的多個MHC-I和MHC-II等位基因呈遞，並包含與中和抗體相關的線性B細胞表位。為了找出最佳的抗原，研究者首先確定了MHC-II的高覆蓋率區域，然後根據它們的MHC-I覆蓋率對它們進行排序。對於得分高的抗原序列，進一步在IEDB資料庫上搜索它們具有90%序列相似性的候選抗原，以評估是否有任何候選抗原曾經被作為B細胞或T細胞的表位。據此，研究者發現了S蛋白494-508是非常好的候選抗原。它不僅能被MHC很好呈遞，而且是S蛋白受體結合結構域附近的預測B細胞表位。
這項研究對於2019-nCoV相關疫苗的開發影響深遠，甚至要超過這件事本身---針對任何病原體疫苗的開發都可以遵循這樣的思路。並且，結合臨床數據，這一工作也能揭示抗原呈遞分數與疫苗功效之間的聯繫。
原文連結：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.19.955484v1