【文獻推送】Nat. Nanotechnol.|DNA電位計監測細胞器膜電位

2021-01-21 黃碩課題組

大家好，今天給大家介紹一篇最近發表於 Nature Nanotechnology的工作，題目為：「A DNA-based voltmeter for organelles」。通訊作者為美國芝加哥大學的Yamuna Krishnan教授，她的研究興趣在於DNA納米技術應用於細胞生物學定量化學成像。近幾年Yamuna Krishnan課題組開發了多種有反映細胞內Ca2+、pH、Cl-水平和酶活性等功能的定量螢光化學傳感器。

所有活細胞都像微型電池。胞質或細胞內部以及不同的細胞區室和細胞器內部的離子濃度不同，因此在不同的隔室之間產生電荷差，從而形成膜電位Vmem。它對我們的身體正常工作至關重要，例如膜電位的快速變化控制著我們的心跳，並增強了腦細胞用來交流的電信號。然而，監測Vmem的動態變化手段非常很有限，膜片鉗電生理學是探查Vmem的金標準，具有很高的靈敏度，但是通量低，屬於高度侵入性方法，因此難以在較長的時間內測試。最近興起的螢光方法為活細胞膜電位的測試帶來了新的思路[1,2]：用電壓敏感的螢光染料處理活細胞，然後用顯微鏡對其成像。當細胞的膜電位改變時，染料會發光。但是目前也仍然只能實現質膜電位的準確測試，對於細胞器電位，始終由於不易定位，需要耐受極端pH而測試難度極高。

在這篇工作中，作者受到經典膜電位測試裝置的啟發，結合電壓敏感的螢光分子，設計了一種基於DNA的模塊化螢光膜電位計，命名為Voltair，可以自由應用到質膜電位和早期內體、晚期內體、溶酶體、再循環內體和反高爾基體網絡等細胞器膜電位的測試。

具體來講，Voltair是三個模塊（38個鹼基對）組成的DNA雙鏈體，它包含(a) 報告探針：基於 VoltageFluor 2.1.Cl設計的PeT 類型螢光報告基團，其中富電子供體到螢光團間的電子轉移受到細胞膜電位去極化和超極化的控制; (b)「參考探針」：對pH，電壓和其他離子不敏感的光穩定性參比螢光基團；(c)定位模塊：針對不同細胞器的靶向定位分子。傳統膜電位測試是通過插入在感興趣的生物膜中的樣品電極和位於膜外的參考電極這兩個電極的電位差來測量的。Voltair使用類似的概念，將插入生物膜中的報告探針的螢光與位於生物膜外部的參考探針在不同波長處的螢光進行比較（圖1a），對膜電位進行定量。

圖1. Voltair 的設計和表徵

第一步，作者用POPE作為定位模塊進行質膜的靶向和探測膜電位（圖1c），並與傳統方法的結果進行對比，驗證VoltairPM的準確性。作者先使用全細胞電壓鉗對HEK 293T細胞施加-100 ~ +100mV電壓，獲得了質膜超極化和去極化轉換過程中膜電位和兩個螢光團之比G/R的相關關係（圖1d）。隨後去掉外加電壓，在靜息條件下測試了質膜的靜息電位，約為-50mV（圖1e），與膜片鉗測試結果相符，證明Voltair的準確性。

第二步，作者又更換了定位模塊，使用雙鏈DNA自身靶向清道夫受體 (MSR1)，測試內吞過程中早期內體、成熟內體、晚期內體、溶酶體膜電位。首先驗證了靶向的準確性（圖2）。對MSR1和VoltairIM進行共定位成像並分析兩者皮爾遜相關係數，結果表明VoltairIM可以80%以上的定位於MSR1，並產生螢光。通過加入mBSA競爭MSR1，則MSR1無法再觀測到VoltairIM的螢光，也證明了VoltairIM進入內吞過程是MSR1介導的。

圖2. 將VoltairIM 靶向特定內吞細胞器的膜

第三步，作者測試了內吞過程靜息膜電位。獲得的不同細胞系的溶酶體膜電位不同，對於HEK 293T細胞，其早期內體、晚期內體、溶酶體的靜息膜電位分別為+153mV, +46mV和+116mV（圖3）。接下來針對溶酶體在藥理學調節劑作用下的膜電位進行測試（圖4）。溶酶體膜上含有多種分子泵和離子通道，作者分別驗證了這幾種通道的抑制劑或激活劑對溶酶體的膜電位影響：對於V-ATPase，Baf-A1的抑制中和了細胞酸化引起的膜電位，的確引起了膜電位的降低；對於TRPML1,激活劑ML-SA1促進了鈣離子釋放，使膜電位降低，且該過程僅發生於溶酶體，對於早期內體無影響；對於TRPML1的抑制元件mTORC1，抑制劑Torin-1的加入使mTORC1解除對TRPML1的抑制，也造成了膜電位降低。至此，作者證明了VoltairIM可以準確的測試內吞過程細胞器膜電位，並監測膜電位的改變。

圖3. VoltairIM對內吞過程細胞器膜靜息電位測試


圖4. VoltairIM測試溶酶體在藥理學調節劑作用下的膜電位變化

第四步，作者將定位模塊改造為(1) RNA適配體用於靶向人轉鐵蛋白受體 (TfR)，測試再循環內體 (EE) 膜電位; (2) 弗林蛋白酶靶向弗林蛋白酶抗體 (scFv-furin)，測試反向高爾基網絡 (TGN) 膜電位。獲得了VEE為+65mV，VTGN膜電位+121mV。而這兩者的膜電位在此前均是被認為是微弱的可被忽略的。更重要的是，作者發現了兩者的膜電位與V-ATPase的關係：通過比較添加抑制劑Baf-A1前後膜電位大小，作者發現EE的膜電位幾乎不受V-ATPase活性影響，而TGN與溶酶體相似，在V-ATPase被抑制後膜電位顯著減小，然而未減小到0mV，這表明TGN處存在其他電生轉運蛋白對VTGN有貢獻，比如Na+/K+泵。

圖5. VoltairEE和VoltairTGN表徵再循環內體和反高爾基體網絡膜電位

最後，作者進行了溶酶體膜電位的延時成像。胞質Ca2+水平受內質網、線粒體、質膜等各種細胞器調節，但溶酶體的貢獻未知。通過細胞外ATP通過與質膜上的P2嘌呤能受體相互作用，提高胞質Ca2+水平，測試Ca2+水平升高過程COS-7細胞溶酶體膜電位變化（圖6）。溶酶體在ATP加入後約50s產生VLy的顯著升高，維持100s後恢復，此時胞質鈣離子水平基本恢復正常。證明溶酶體也有助於維持胞質的Ca2+水平。

圖6. 溶酶體膜電位的延時成像

總結一下，作者參考傳統膜電勢的測試原理，設計了一種基於DNA的模塊化的細胞器膜電位計Voltair ，由電壓敏感性螢光分子、參比螢光分子和定位模塊三部分組成。首次成功實現了質膜、內吞過程中早期內體、晚期內體、溶酶體、再循環內體和反高爾基體網絡的膜電位的準確定量。當細胞器膜破裂時膜電位降至零，因此 Voltair 還可以充當細胞器損傷和膜修復的實時報告者。


【文章連結】

https://www.nature.com/articles/s41565-020-00784-1


【DOI號】

https://doi.org/10.1038/s41565-020-00784-1


【參考文獻】

[1]  Miller, E. W. et al. eLife 8, e44522 (2019);

[2]  Miller, E. W. et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 33, 74–80 (2016).



【本文作者】

劉瑤

黃碩課題組博士生

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