最新Nature Nanotechnology：給細胞器裝個電壓表

2020-11-07 研之成理


▲第一作者：Anand Saminathan

通訊作者：Yamuna Krishnan

通訊單位：美國芝加哥大學

DOI: https://doi.org/10.1038/s41565-020-00784-1


背景介紹

由於缺乏合適的工具，膜電位在大多數細胞內細胞器的作用仍未被探索。


本文亮點

● 在此，作者介紹了Voltair，一種螢光DNA納米器件，它可以報告絕對膜電位，並且可以靶向活細胞中的細胞器。

● Voltair包括一個電壓敏感螢光團和一個用於比率測定的參考螢光團，並作為內吞示蹤劑。利用Voltair，作者可以在活細胞中原位測量不同細胞器的膜電位。

● Voltair可以潛在地指導生物相容電子學的合理設計，並增強我們對膜電位如何調節細胞器生物學的理解。


圖文解析

伏特靜息膜電位的設計和表徵

通過兩個電極之間的電勢差來測量的:一個插入生物膜的樣品電極和一個位於膜外的參考電極。伏爾泰使用了類似的概念，將插入生物膜的報告探針的螢光與位於生物膜外不同波長的參考探針的螢光進行比較。

▲圖1 電壓探針的設計與表徵。


a，伏特計工作原理示意圖:測量探針(G，綠色)是一種電壓敏感染料(RVF)結合到一個DNA雙鏈，該雙鏈是通過附著在一個脂質錨(POPE)上膜拴著的。參比探針(R，紅色)是一個DNA雙鏈與參比染料(Atto647N，紅色球體)一起與RVF報告膜電位比率。

b，RVF (RVF-N3)和脂質錨定POPE的可接合版本的結構。

c，顯示RVF與Atto647N螢光強度(G/R)像素比的偽彩色圖像。

d, HEK 293T細胞中電壓PM(灰色痕跡)和未修飾RVF(紅色痕跡)作為質膜電位的傳感器響應。插圖:電壓PM( (黑色)和未修改RVF(紅色)從0到100 mV的信號變化百分比(SC)。

e、f靜息細胞(Res)細胞膜的絕對G/R值和夾住細胞電壓在100mv和+ 100mv時的值。


靶向VoltairIM到特定內吞細胞器的膜

接下來，作者利用清道夫受體介導的內吞作用將VoltairIM靶向到溶酶體內途徑的細胞器上。基於DNA的探針可以標記表達清道夫受體的不同細胞類型中的特定內吞細胞器。由於HEK 293T細胞不表達清除劑受體26，我們通過瞬時轉染在HEK 293T細胞中過表達融合到CFP的人巨噬細胞清除劑受體(hMSR1)。這導致了VoltairIM的有效內部化。hMSR1-CFP與VoltairIM的共定位和競爭實驗表明，VoltairIM的攝取是由清道夫受體介導的。

▲圖2 將VoltairIM靶向於特定的內吞細胞器膜。


a、靶向策略示意圖：VoltairIM通過結合清道夫受體進行清道夫受體介導的內吞作用。細胞內吞VoltairIM以時間依賴的方式從質膜到早期內質體、晚期內質體和溶酶體。

b、轉染hek293t細胞的內化VoltairIM（紅通道）與人巨噬細胞清除劑受體（hmsr1cfp，綠色通道）之間的典型共定位。

c、在有無mBSA（30當量）的情況下，細胞內VoltairIM攝取的標準化強度，誤差條表示n=30個細胞的三個獨立試驗的平均值±s.e.m。

d、不同內吞細胞器標記物（綠色通道）和VoltairIM（紅色通道）在指定的追逐時間內的代表性共定位。早期內切體用轉鐵蛋白alex546（Tf）標記，晚期內切體用rab7mrfp（Rab7）標記，溶酶體用TMR葡聚糖（右旋糖酐）標記。

e、Voltair共定位（CL）的Pearson相關係數（PCC）與d中相應的內吞標記物以及像素位移（PS）。


原位測量絕對溶酶體膜電位

首先，作者驗證了VoltairIM在溶酶體中的作用，從電生理學給出了廣泛的經驗知識。將hk293t細胞中VoltairIM標記溶酶體的G和R通道中的螢光圖像轉換為G/R圖像，從中可以獲得G/R分布。考慮到腔為陽性，胞質面為陰性，溶酶體膜電位為+114mv。這與不同細胞類型的電生理學一致。

▲圖3 VoltairIM測量溶酶體膜電位。


a、用VoltairIM標記的放大溶酶體的電壓鉗位示意圖。

b、 假彩色圖像顯示在溶酶體內部小葉上標記的VoltairIM的像素G/R比，作為整個溶酶體電壓鉗位施加的膜電位的函數。

c、VoltairIM灰色跡線，正方形）和VoltairIM（紅色跡線，圓圈）的傳感器響應作為膜電位（PMP，質膜電位；IMP，細胞內膜電位）的函數。插圖：VoltairPM（黑色）和VoltairIM（紅色）信號在c中從0到100 mV的百分比變化。

d、 不同細胞型VoltairIM標記溶酶體的代表性偽彩色G/R圖像。

e、 在V-ATP酶抑制劑巴菲羅黴素（Baf-A1，500 nM）、mTORC1抑制劑Torin-1（1μM）、TRPML1激活劑ML-SA1（20μM）和Slo1激活劑NS1619（15μM）存在下，測定COS-7、RAW 264.7、BHK-21細胞的溶酶體靜息膜電位值（VLy）和HEK 293T值。

f、 在VoltairIM標記的溶酶體（紅色軌跡）和VoltairIM標記的內體（藍色軌跡）中，ΔVmem與TRPML1激活時間的時間推移圖。


總結：

本文證明了Na+或K+在建立早期內體高膜電位中的作用。再生內膜和質膜表現出相似的電化學特性。先前假設可以忽略不計的跨高爾基體網絡的膜電位實際上與溶酶體40的膜電位一樣高；然而，它並不是完全由V-ATPase驅動的。通過非侵入性測量細胞器中的膜電位，作者可以測試膜電位是如何調節細胞器功能的。


原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41565-020-00784-1

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