線粒體、溶酶體、內質網等多種細胞器組成的結構相對獨立、功能緊密聯繫的細胞內膜系統，高效支撐了機體正常生理活動功能。細胞內膜系統失調導致細胞代謝穩態失衡，胞內信號網絡調節異常，造成不可控的細胞惡性調控，促使腫瘤等惡性疾病發生。
不同細胞器具有各自獨特的核酸、蛋白、代謝物質組成，促進了各類生化反應的高效運轉，支持其各自獨特能量代謝等功能。對細胞器蛋白組學、代謝組學等分析有效揭示了各細胞器在能量代謝平衡等重要細胞活動規律中的獨特功能和動態關聯。相對的，作為細胞三類主要生物分子組分之一的核酸，其作為細胞器組分的分布規律及其參與細胞代謝功能的研究尚少。因此，對細胞器獨特核酸組分及其相關作用蛋白、代謝物質的精細研究將是細胞器調控能量代謝動態行為解析的重要突破口。
長鏈非編碼RNA(LncRNA)作為一類長度大於200 nt的非編碼RNA，在細胞代謝、腫瘤發生發展進程中發揮重要調控功能。浙江大學林愛福等課題組在內的一系列前期研究，發現細胞膜脂結合LINK-A促進了細胞質膜PIP3-AKT信號轉導，細胞質CamK-A介導了Ca2+信號與NF-κB信號交互，細胞核BCAR4介導了Hedgehoge-Hippo信號轉錄協同，展現了lncRNA生物學功能與其亞細胞定位的緊密聯繫。因此，探明LncRNAs細胞空間層級分布及其如何在生理病理條件下動態調控細胞代謝進程及腫瘤病變發生具有重要意義。
2021年01月04日，浙江大學生命科學學院林愛福課題組在 Nature Metabolism 雜誌在線發表題為：Mitochondrial Long Non-coding RNA GAS5 Tunes TCA Metabolism in Response to Nutrient Stress 的研究論文。
該研究通過建立細胞器免疫親和純化體系，繪製了細胞器lncRNA圖譜，並從中揭示了線粒體lncRNA GAS5在幫助細胞應對能源匱乏條件，介導TCA循環代謝區室解離中的重要調控作用，為研究lncRNA亞細胞空間動態調控與人類疾病發生的聯繫提供了嶄新的視角。
為了精確解析細胞器RNA組分分布，研究者們經過探索優化建立了一套細胞器免疫親和純化體系。傳統的細胞器純化方法主要依賴於蔗糖、percoll等介質的密度梯度離心法，根據不同細胞器的不同沉降係數將其分離，但是由於一些細胞器間的沉降係數範圍重疊（如線粒體、溶酶體）難以達到精確的RNA檢測解析度。此外，近來揭示的大量顆粒狀無膜亞細胞結構，尤其是能抵抗RNase消化的RNA granule類顆粒，往往因其更加離散的沉降係數而導致在各細胞器組分中的汙染。
因此，作者開發了基於免疫親和純化的細胞器純化方案，使用簡化的細胞勻漿-離心法獲得輕線粒體組分懸液（LMF），再通過線粒體表面標誌蛋白Tom20或溶酶體表面標誌蛋白Lamp1的抗體分別捕獲LMF懸液中線粒體及溶酶體組分，最後通過Protein A/G磁珠富集並磁性分離得到免疫親和純化的完整細胞器。
該細胞器免疫親和純化體系獲得的細胞器可以極大避免細胞器間交叉汙染及無膜亞細胞結構的串擾，且因無需提前外源轉染或化學處理細胞，可以更好保留細胞器生化表徵完整性，適用於不同應激條件處理下的各細胞器組分的動態分析及組織中細胞器的提取分析。
藉助上述細胞器免疫親和純化體系聯合RNA-seq高通量測序分析，作者建立了細胞器lncRNA圖譜。該圖譜顯示免疫親和純化法相比傳統離心方法具有更好的RNA富集效率及分辨效果，揭示了細胞器lncRNA約佔總lncRNA的5.2%。作者進一步通過生信分析、qPCR驗證、siRNA篩選，揭示了細胞器lncRNA潛在參與了所在細胞器相關功能的調控。
圖1 細胞器免疫親和純化體系流程示意圖及細胞器lncRNA候選分子的選擇
在所建立的細胞器lncRNA圖譜中，作者通過細胞器提取-qPCR篩選了高豐度的細胞器lncRNA，再通過線粒體/溶酶體定位的葡萄糖敏感性及線粒體ATP產能/溶酶體表面AMPK激活作為指標，篩選了具有潛在細胞器相關代謝調控功能的細胞器lncRNA，包括線粒體能量代謝功能緊密相關的lncRNAGAS5（Growth-Arrest-Specific 5）。研究者進一步通過FISH、線粒體分離-qPCR、ATP檢測、NADH/NAD+檢測等實驗證實了GAS5的糖敏感性線粒體定位及其對線粒體ATP、NADH產生的影響。GAS5已知報導通過競爭抑制GR（glucocorticoid receptor）轉錄活性，microRNA緩衝海綿等途徑抑制細胞生長增殖，是廣泛的抑癌分子。
但是這些研究都無法完全解釋GAS5的糖敏感性亞細胞空間動態行為及其對線粒體代謝的調控功能。作者通過生物素標記的RNA-pulldown聯合蛋白質譜分析，鑑定了GAS5直接靶向作用的線粒體蛋白MDH2（Malate dehydrogenase, mitochondrial）。MDH2是線粒體TCA循環中維持能量代謝穩態循環的節點分子，研究者進一步發現MDH2與其上下遊FH、CS可以偶聯形成代謝區室，通過反應底物串聯幫助MDH2在細胞內完成逆標準吉布斯自由能（ΔG0』）反應。敲低GAS5會增強MDH2代謝區室穩定，並削弱該代謝區室對糖的敏感性；而過表達GAS5則可以模擬糖匱乏信號，抑制FH-MDH2-CS代謝區室的形成，並造成檸檬酸、蘋果酸水平異常，線粒體能量代謝失調，進而抑制細胞生長增殖。線粒體內往往具有很高的乙醯輔酶A濃度，諸多線粒體代謝相關蛋白受乙醯化修飾調控。
通過對MDH2-K185/301/307/314四個乙醯化位點的4KR突變，作者發現MDH2乙醯化修飾對FH-MDH2-CS代謝區室穩定具有中樞作用。GAS5通過動態線粒體轉位，可以響應並傳遞葡萄糖匱乏信號，促進MDH2募集SIRT3並下調MDH2乙醯化修飾，抑制MDH2與FH/CS互作形成區室，從而下調TCA循環代謝流，抑制線粒體代謝。
代謝重排是腫瘤進展重要驅動因子，線粒體代謝提供了大量生物合成的物質原料，對腫瘤發生發展至關重要。研究者發現GAS5在乳腺癌中低表達且與腫瘤良好預後正相關，而MDH2、CS、FH在腫瘤中高表達，與腫瘤不良預後相關。過表達GAS5顯著抑制腫瘤中FH-MDH2-CS代謝區室形成，TCA循環及腫瘤增殖，從而證實了線粒體TCA循環對腫瘤發生發展的重要支持作用，而腫瘤低表達GAS5幫助腫瘤細胞規避了能源物質缺乏條件下的線粒體代謝抑制效應，促進了腫瘤進展。
圖 2 LncRNA亞細胞分布及線粒體GAS5的機制示意圖
總的來說，本研究通過建立細胞器免疫親和純化體系，繪製了細胞器lncRNA圖譜，並從中揭示了線粒體lncRNAGAS5對TCA循環MDH2代謝區室的重要調節功能，為線粒體代謝支持腫瘤發生發展提供了新的證據，為腫瘤臨床診斷提供了新的潛在分子靶標GAS5。
據悉，浙江大學生命科學學/癌症研究院林愛福研究員為該論文的通訊作者。浙江大學生命科學學博士研究生桑凌傑、楊作臻及中山大學腫瘤防治中心鞠懷強副研究員為該論文的共同第一作者。值得一提的是，浙江大學15級本科生龔杭荻同學與16級本科生楊洛嘉同學在該研究探索階段做出了積極貢獻。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s42255-020-00325-z