30年的謎題終獲解,兩篇Science,揭示miRNA靶向降解機制

2020-11-24 健康界

MicroRNAs (miRNAs) 是一類由內源基因編碼的長度約為 22 個核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子，參與轉錄後基因表達調控，抑制信使 RNA (mRNAs)。


Argonaute (AGO) 蛋白是 RNA 介導的轉錄後基因調控的關鍵蛋白，為 miRNA 提供錨位點，形成 RNA 誘導沉默複合體 RISC 達到降解靶基因或者抑制翻譯的目的。

 

自 1993 年 miRNAs 被發現以來，研究人員已經積累了數百種不同 miRNA 分子及其生成、成熟在發育、生理和疾病中的作用機制。儘管人類早已明確 miRNA 半衰期非常短，細胞在使用完畢後如何處理（降解）miRNA，精確調控 miRNA 周轉機制的蛋白和執行策略知之甚少。

 

近三十多年來，研究人員一直在尋找細胞降解 miRNAs 的機制。近日，Science 雜誌同期發表了兩篇關於細胞降解 miRNAs 新機制的重磅研究成果。

 

德克薩斯大學西南醫學中心分子生物學系 Joshua T. Mendell 教授研究團隊發現了一種細胞降解 miRNAs 的新機制。該成果以 A ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA decay independently of tailing and trimming 為題於 2020 年 11 月 12 日在 Science 雜誌在線發表。



 

AGO 蛋白在 miRNA 通路中發揮多種功能，通過產生 pre-miRNA 參與 miRNA 裝配；同時 AGO 蛋白是 RISC 效應器蛋白，介導 mRNA 降解、去穩定作用或者轉錄抑制。

 

如前所述，裝載至 AGO 蛋白中的 miRNAs 具有其周轉 (turnover) 動力學。通過靶向 miRNA 的降解 (target-directed miRNA degradation, TDMD) 效應，誘導 miRNA 快速降解。目前，認為 TDMD 效應與加尾 (tailing, 加上 U 或 A) 和修剪 (trimming, 截短) 有關，但 TDMD 介導 miRNA 降解機制尚未闡明。

 

AGO-miRNA 複合體

 

Joshua T. Mendell 教授研究團隊通過 3' UTR 的 8 個與 miR-7 結合位點完全互補的增強型綠色螢光蛋白 (EGFP) 轉錄本 EGFPmiR-7，成功構建了可監測 miR-7 活性的螢光報告 K562 細胞株。

 

採用全基因組 CRISPR 篩選策略，Joshua T. Mendell 教授研究團隊希望通過對已知 CYRANO-miR-7 中 TDMD 效應的鑑定，初步篩選執行 TDMD 的調控因子。

 

此外，為判斷 TDMD 依賴性調控 miR-7，研究人員在 CYRANO-/- EGFPmiR-7 報告細胞中進行了平行全基因組 CRISPR 篩選。

 

全基因組 CRISPR-Cas9 篩選鎖定 ——ZSWIM8 泛素連接酶


全基因組 CRISPR 篩選鑑定後發現在 CYRANO 依賴的結合位點中，cullin-RING 泛素連接酶 (CRL) 的組件得分最高 (ZSWIM8、ELOB、ELOC、CUL3、RBX1 和 ARIH1)，而 CRLs 是 E3 泛素連接酶的最大超家族。


CYRANO 依賴的結合位點中，cullin-RING 泛素連接酶 (CRL) 排名最高 (ZSWIM8、ELOB、ELOC、CUL3、RBX1 和 ARIH1)，TDMD 全基因組 CRISPR-Cas9 篩選
ZSWIM8 E3 泛素連接酶及其組件是 TDMD 必要條件
與全基因組 CRISPR-Cas9 篩選結果一致，敲除 ZSWIM8 泛素連接酶的每個單獨組件成分均可導致 EGFPmiR-7 報告基因在 CYRANO+/+ 細胞中被抑制，證實 ZSWIM8 E3 泛素連接酶及其組件是 TDMD 的必要條件。
Northern blotting 證實敲除 ZSWIM8 泛素連接酶組分的 CYRANO+/+ K562 細胞中 miR-7 水平提高 40 倍，但對 CYRANO-/- 細胞中 miR-7 豐度無影響。 ZSWIM8 E3 泛素連接酶組件是 TDMD 的必要條件
一專多能 ——ZSWIM8 泛素連接酶功能的普適性
接下來，Joshua T. Mendell 教授研究團隊測試了 ZSWIM8 泛素連接酶功能的普適性 —— 即 ZSWIM8 泛素連接酶是否僅可在 CYRANO 誘導的 TDMD 中特異性發揮功能，還是在其他 TDMD 中同樣存在。
NREP 是一種蛋白質編碼基因，在其 3 ' UTR 中包含 miR-29b 結合位點，可觸發這種 miRNA 降解。Joshua T. Mendell 教授研究團隊分別克隆了人 NREP 下遊 3 ' UTR 基因（包含 miR-29b 結合位點）和突變 miR-29 結合位點（NREP_29a/b）。
敲除 ZSWIM8 CRL 組件可穩定 NREP_29a/b 表達細胞中的 miR-29a 和 miR-29b。同表達與 miRNA - 互補的突變 NREP 轉錄本細胞相比，該轉錄本的表達導致 miR-29a 和 miR-29b 的下調。NREP_29a/b 促進了 miR-29a 和 miR-29b 的加尾化，敲除 ZSWIM8 複合物組件成分使上述修飾進一步在細胞中積累。
在不同細胞系中，ZSWIM8 泛素連接酶在兩種誘導 TDMD 途徑中均可發揮作用。此外，上述結果還證實 3' miRNA 修飾不足以觸發 miRNA 降解。
通過免疫共沉澱等實驗，證實 ZSWIM8 複合體與 AGO2 存在相互作用。ZSWIM8 泛素連接酶促進參與 TDMD 相互作用的 AGO 蛋白降解，導致靶向 miRNA 釋放並最終降解。
此外，抑制蛋白酶體活性保留溶酶體活性，可部分抑制以 ZSWIM8 依賴方式進行的 TDMD miRNAs 降解效應。
在 ZSWIM8 泛素連接酶促進 TDMD 途徑誘導靶點 AGO 蛋白降解的預測模型中，特異的賴氨酸殘基作為泛素修飾的受體，對 AGO 蛋白降解過程至關重要。通過將 25 個賴氨酸分別單獨或成對突變為精氨酸，並檢測突變後的 AGO1/2/3 三敲細胞中 miR-7 水平變化，證實 AGO2 蛋白表面賴氨酸是 TDMD 路徑必需的。
ZSWIM8 泛素連接酶介導的 TDMD 不需加尾和剪切
在 ZSWIM8 敲除細胞中與 TDMD 底物結合的 miRNA 加尾和剪切中間產物積累，提示 3'miRNA 修飾不足以觸發 miRNA 降解。作者含有或不包含 3'- 末端 2'- 甲基（3'miRNA 修飾）miR-7 雙體證實了 3' 修飾 miRNAs 可能是 TDMD 途徑的必要中間體，其可能作為 ZSWIM8 複合物招募的信號。
ZSWIM8 複合體在多種細胞中均可調節 miRNA 降解
最後，Joshua T. Mendell 教授研究團隊通過 RNA 測序證實除了 K562 細胞外，ZSWIM8 複合體在 HEK293T 細胞等多種細胞中均可調節 miRNA 的表達。
在不同細胞系中，ZSWIM8 泛素連接酶複合體調控 miRNA 的表達
TDMD 早在十多年前就被發現，但通過這一途徑介導 miRNA 降解的分子機制一直是一團迷霧。
Joshua T. Mendell 教授研究團隊報導的 ZSWIM8 cullin-RING 泛素連接酶是 TDMD 介導 miRNA 降解的關鍵機制。ZSWIM8 cullin-RING 泛素連接酶在 TDMD 塑造不同細胞 miRNA 穩定性和多樣性方面發揮了重要作用。
ZSWIM8 複合體泛素化及可相關蛋白與 TDMD 靶標結合時，導致包含 miRNA 複合物的蛋白酶體降解。miRNA 的釋放可導致其被細胞質 RNA 酶進一步降解
miRNA 降解機制在動物發育期間和跨組織中廣泛地控制 miRNA 的水平。考慮到大量研究證實 miRNA 的異常水平與各種疾病有關，尋找控制 miRNA 降解的方法 —— 無論是根除細胞中有問題的 miRNA 還是保留有益的 miRNA—— 可能代表一種基於基因調控的新的疾病解決方案。
霍華德・休斯醫學研究所、麻省理工學院、Whitehead 研究所的 David Bartel 教授研究團隊同樣證實了靶向 miRNA 降解 (TDMD) 需要 ZSWIM8 culline3 泛素連接酶，支持了通過泛素 - 蛋白酶體途徑靶向 AGO 蛋白水解暴露 miRNA 降解的機制模型。
功能缺失研究表明，ZSWIM8 Cullin-RING 連接酶加速了哺乳動物、果蠅和線蟲中大部分 miRNAs 降解。該成果以： The ZSWIM8 ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA degradation  為題於 2020 年 11 月 12 日在 Science 雜誌在線發表。
1. Jaeil Han, et al. A ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA decay independently of tailing and trimming. Science, 2020. DOI: 10.1126/science.abc9546
2. Charlie Y. Shi, et al. The ZSWIM8 ubiquitin ligase mediates target-directed microRNA degradation. Science, 2020. DOI: 10.1126/science.abc9359
3. Benjamin Kleaveland, et al. A Network of Noncoding Regulatory RNAs Acts in the Mammalian Brain. Cell, 2018. 174(2):350-362.e17. DOI: 10.1016/j.cell.2018.05.022

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