蔣華良:冷凍電鏡結構測定發現G蛋白偶聯受體信號傳導新化學修飾

2021-01-19 BioArt生物藝術

編者按：

2021年1月12日，中科院上海藥物研究所蔣華良院士在Science China Life Sciences發表文章Cryo-EM structure determination captures new chemical modification of protein，對1月6日發表在Nature上的一篇文章進行了點評（詳見BioArt微信公眾號報導：Nature | 孫金鵬/張巖/徐華強合作揭示黏附類受體GPR97感知糖皮質激素並激活Go的結構基礎），同時還對冷凍電鏡在揭示蛋白質修飾方面進行了展望。

撰文 | 蔣華良 院士（中國科學院上海藥物研究所）

責編 | Qi

以生物學「中心法則」的建立為標誌，人類基本掌握了生物物種遺傳和進化的分子機制。然而，進入二十一世紀以來，隨著人類基因組計劃的完成，人們很快發現，雖然生命個體的演化主要取決於遺傳基因的序列，但其複雜性和多樣性無法僅由「中心法則」解釋。包括蛋白質、核酸和多糖在內的生物大分子是生命活動的基本「元件」，為生命過程提供了物質基礎，其自身則處於動態的化學修飾和調控當中。這些生物大分子的動態化學修飾在生物個體的發育和細胞命運的調控中均扮演了關鍵角色，並對疾病的發生和發展起著決定性的作用。生物大分子的動態修飾已成為當前生命科學最受關注的前沿領域之一，也是化學與生命科學和醫學交叉界面上最為活躍的研究前沿。因此，2017年國家自然科學基金委啟動了「生物大分子動態修飾與化學幹預」重大研究計劃，發現新的生物大分子的化學修飾，進而研究新修飾的生物學功能，是本重大研究計劃的一項重要任務。作為該重大研究計劃專家組組長，我一直關注國內有關方面的研究。

2021年1月6日，來自山東大學的孫金鵬團隊、浙江大學的張巖團隊和上海藥物研究所的徐華強團隊在Nature雜誌上合作發表了一篇題為 Structures of the glucocorticoid-bound adhesion receptor GPR97–Go complex的文章（Nature | 孫金鵬/張巖/徐華強合作揭示黏附類受體GPR97感知糖皮質激素並激活Go的結構基礎），這項研究解析了黏附類G-蛋白偶聯受體 (GPCR) GPR97在糖皮質激素激活狀態下與G蛋白複合物的三維結構，並揭示了內源性配體糖皮質激素氫化可的松和抗炎藥物倍氯米松的作用機制。

該研究引起我興趣的不是GPCR-G蛋白及其內外源性配體複合物的電鏡結構，而是電鏡結構測定結合蛋白質質譜 (MS) 分析發現的GPCR與G-蛋白結合時G-蛋白上棕櫚醯化修飾，據我所知，這是在G-蛋白α-亞基C末端上首次發現的新修飾，預示著結構生物學技術可能可以介入生物大分子化學修飾研究，為表觀遺傳學等領域的研究提供新的技術和策略。

孫金鵬、張巖和徐華強等利用單顆粒冷凍電鏡技術獲得了GPR97-Go-氫化可的松以及GPR97-Go-倍氯米松兩個三元複合物的三維結構，分別率分別為2.9 和3.1。在解析結構過程中，他們發現Go蛋白C末端有多餘的電鏡密度，長度約17 ，看上去似乎像長鏈脂肪酸。於是他們請國家蛋白質中心的楊靖研究員課題組進行質譜鑑定，發現Go蛋白C末端C351側鏈有棕櫚酸化修飾，再反過去擬合電鏡密度，發現棕櫚酸的羧基與C351的巰基形成共價鍵，脂肪鏈插入在TM3和TM5之間 （見圖1）。

圖1. Go的C351棕櫚醯化修飾及其與GPR97的相互作用，灰色網顯示棕櫚醯化修飾的電鏡密度

上述研究並非第一次用結構生物學方法觀察到蛋白質翻譯後修飾。在2015至2017年間，也是徐華強課題組利用自由電子雷射X射線技術解析了視紫紅質素受體(Rhodopsin) 與下遊信號傳導蛋白Arrestin複合物的晶體結構【1, 2】，這也是第一個GPCR-Arrestin複合物三維結構。這些結構解析首次在GPCR三維結構水平觀察到蛋白質的化學修飾，他們的結構清楚地展示了視紫紅質素受體C末端磷酸化修飾的模式，並通過功能驗證，首次獲得了GPCR磷酸化密碼（見圖2），為理解整個GPCR信號特異性傳導提供了分子與結構基礎。這兩項工作影響較大，然而GPCR的C末端磷酸化修飾早就有人報導，徐華強等第一次在三維結構上看到了具體結構信息。這一次的工作又有新的進展，用結構生物學技術發現了蛋白質的新化學修飾，並獲得了三維結構信息。

圖2.視紫紅質素受體-Arrestin複合物三維結構圖，其中園圈標註視紫紅質素受體的C末端T336和S338磷酸化位點

用傳統的X-衍射晶體學方法很難測定修飾後蛋白質等生物大分子的三維結構，我個人認為X-衍射晶體學對表達蛋白質的純度和結晶的要求較高，為了得到高純度且高質量的晶體，蛋白質等生物大分子固有的化學修飾被破壞，有些化學修飾後的蛋白質（如糖基化蛋白質）不容易獲得高質量的晶體，核磁共振（NMR）測定生物大分子的結構又比較困難。這些可能是以往的結構生物學方法和技術很難觀察到蛋白質等生物大分子的修飾的原因。

徐華強等用自由電子雷射X-射線技術測定的紫紅質素受體-Arrestin複合物的三維結構中看到磷酸化修飾，可能也是因為自由電子雷射技術測定結構時對蛋白質的晶體要求不高。冷凍電鏡技術的發展，最後能測定較高解析度和分子量較小生物大分子的三維結構，特別是能用於蛋白質、DNA或RNA、小分子等複合物的三維結構的測定，由於不需要結晶過程，如樣品處理得當，蛋白質等生物大分子的內源性化學修飾在單顆粒形成中得以保留，冷凍電鏡測定的高解析度三維結構，可以觀察到某些化學修飾的位點和電鏡密度，再有的放矢地進行質譜測定，可以較為準確地發現發生了何種修飾以及在三維結構水平上推出這種化學修飾的調控作用，為功能研究提供重要線索。

原文連結：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-03083-w

https://engine.scichina.com/publisher/scp/journal/SCLS/doi/10.1007/s11427-021-1886-8?slug=abstract

參考文獻

1. Y Kang, XE Zhou, X Gao, Y He, W Liu, A Ishchenko, A Barty, TA White, …, H. Eric Xu (2015) Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature 523 (7562), 561-567

2. XE Zhou, Y He, PW de Waal, X Gao, Y Kang, N Van Eps, Y Yin, K Pal, .. …, H. Eric Xu (2017). Identification of phosphorylation codes for arrestin recruitment by G protein-coupled receptors. Cell170 (3), 457-469. e13

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