基因密碼神來之筆 「重磅」流感疫苗誕生記

疫苗誕生之前的歷史，是一部戰爭與瘟疫交織的歷史。數千年來，人類在微生物面前，常常扮演著一個被動迷茫的弱者。許多致命病原體的攻擊，更讓死神像秋風掃落葉一般，戕害無數手無寸鐵的生靈。當歷史的車輪駛向近代的地平線，天花疫苗終於橫空出世。從中國的人痘接種術，到英國的牛痘接種法在全球推廣，世界各地千百年來反覆爆發的天花病毒，終於在幾十年前被人類徹底消滅。此後，脊灰糖丸、卡介苗、B肝疫苗等相繼推廣，也在不同程度上抑制了致命病毒和細菌，疫苗的防範普及由此為人類醫學發展史掀開了嶄新的篇章。

圖片來源：波士頓兒童醫院網站

然而，免疫探索之路依然任重道遠。流感病毒是最容易影響普通人健康的病原體之一，而小小的流感病毒所導致的恐慌和威脅，也從未停下過侵擾人類的腳步。至今，治療流感尤其是重症患者的藥物療效依然有限，流感疫苗仍是普通人群最應關注的預防手段。北大藥學院院長周德敏帶領團隊利用密碼子擴展技術，通過修改病毒基因編碼和多重誘導病毒突變實驗，研製出一種全新複製缺陷型活病毒流感疫苗，徹底突破了減毒、滅活、亞單位片段等傳統疫苗的研發模式，該成果也被《科學》雜誌列為去年年全球十大科學突破之一。這種高效、低風險、抗突變的疫苗模式，不僅是人類震懾流感病毒的希望，更為我們最終攻克其他痼疾帶來革命性曙光。

周德敏教授1996年完成北醫大與日本筑波大學聯合培養博士課程，之後在Scripps研究所師從PeterG.Schultz教授進行博士後訓練，現任國家973「基於基因密碼子擴展的蛋白質標記新方法」首席科學家，以及天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室系主任，並於2017年12月獲得藥明康德生命化學研究獎傑出成就獎。

周德敏教授（左）與張禮和（右）院士

密碼子擴展術：全抗原活疫苗不是神話

Q：傳統疫苗存在著感染風險、接種效果不佳、難以應對病毒突變等多種挑戰。您團隊研製出的全新流感疫苗如何克服這些挑戰，並體現出獨特優勢？

周德敏教授：傳統疫苗分為減毒、滅活、亞單位、載體疫苗等種類。常見的減毒疫苗注射到人體之後，病原體仍可以在體內複製，如果遇上抵抗力低下的宿主則可能恢復毒力。傳統滅活疫苗不會導致接種者感染，但病毒蛋白結構在滅活過程中一旦被破壞，則可能難以達到理想的接種效果。某些亞單位流感疫苗採用病毒表面少量膜蛋白片段，其接種效果有時也差強人意。

流感病毒基因由八個片段組成，每個片段都包含上百個密碼子。我們的技術要點概括起來非常簡潔：就是將某些基因位點的密碼子修改為終止密碼子（三鹼基UAG），即在天然細胞的環境內，使病毒在關鍵基因位點停止翻譯蛋白質，從而成為失去傳代能力。因此這種全抗原疫苗完整保存了病毒的結構和感染力，可以在接種人體內誘導高效的免疫應答，但是無法複製的病毒對人體造成的風險則降到最低。

流感病毒（圖片來源：NIH官網）

流感病毒表面的包膜會分布了大約500個血凝素刺突（HA）和100個神經氨酸酶刺突（NA）。這兩類刺突都屬於糖蛋白，每一個刺突理論上都可能突變，所以高突變率是疫苗研發的嚴峻挑戰。為了應對挑戰，我們最大可能性模擬了誘導病毒基因突變的內外環境：即模擬人體內部多種免疫通路，以及模擬達菲、金剛烷、幹擾素等常用抗病毒藥物的外部化學環境，讓弱流感病毒疫苗實現多種負反饋性的耐藥性突變。目前我們已經證實了弱流感疫苗甚至可應用於預防強流感。

Q：過去曾有學者通過其他技術製備複製缺陷型病毒疫苗，但轉基因病毒仍存在恢復為野生型病毒的風險。密碼子擴展技術如何防止病毒通過基因突變恢復丟失蛋白，並實現疫苗療效的迭代升級？

周德敏教授：我們團隊完成了對弱流感病毒的全基因掃描，有的基因位點密碼子修改為UAG容易導致該病毒返祖，但是我們也發現了不容易導致返祖的基因位點，將3個以上這樣的位點密碼子修改為UAG，則病毒不再出現突變回野生型病毒的風險。在小鼠實驗階段，我們將把1000個野生流感病毒注入10隻小鼠鼻腔，10天之後老鼠全部死亡；把1億個加裝UAG病毒的疫苗注入小鼠體內，10天後小鼠保持健康且體內可檢測到相關病毒的「全抗原「。

我們的文章投遞到《科學》雜誌之後，有一個編委成員表示，尚未發病的流感病毒攜帶者，如果不慎接種這類新型疫苗是否會產生不良反應？沒想到這個提問，竟然促使我們實現了從預防性疫苗到治療性疫苗的飛躍！眾所周知，多數疫苗為預防性疫苗；治療性疫苗所針對的人群存在不同程度的免疫禁忌、免疫無能或者免疫耐受。所以要研發治療性疫苗，必須通過更為巧妙的方式改造靶抗原的結構和組合，使其相似又相異於預防性疫苗的靶抗原，從而有效打破和逆轉患者的免疫耐受狀態。

密碼子指導蛋白質翻譯（圖片來源：維基百科）

我們發現隨著病毒基因密碼子突變為UAG的位點增多，小鼠患病後再接種相應的病毒疫苗，則清除野生病毒的能力逐漸提升。當疫苗內病毒基因密碼子突變為UAG的位點達到4個，患病小鼠接種該疫苗之後則體內不會在檢測到野生流感病毒。原來，野生病毒受到疫苗中轉基因病毒的質粒侵染，也被迫帶上了UAG這個終止密碼子的枷鎖！這樣的疫苗研製方法不僅對於臨床有重要的轉化價值，更有利於病毒學的基礎研究：通過體外培養，我們是否能夠預測出一種病毒究竟能產生多少種突變？每一種基因突變與環境之間具體有怎樣的聯繫？

神奇細胞系：非天然胺基酸合成工廠

Q：您團隊研製的全新疫苗如果接種在哺乳動物體內，病毒無法實現細胞內複製。那麼該病毒如何實現在體外的大規模製備，並最終投入臨床轉化和市場應用呢？

周德敏教授：在天然細胞中，病毒利用宿主細胞內的天然胺基酸合成蛋白質、進行複製，需要相應的天然轉運RNA（tRNA）和氨醯-tRNA合成酶（aaRS）。而天然細胞內並沒有能與UAG這個密碼子匹配的轉運RNA，所以UAG才會扮演終止密碼子的角色。因此經過基因改造的活病毒疫苗，才不會在接種人群細胞內中複製。

然而終止密碼子其實只是一個相對的概念。如果我們在模式細胞內整合加入特殊的基因，使該細胞表達能夠與UAG匹配的轉運RNA，則UAG將不再是終止密碼子。然後我們再在模式細胞內整合加入特定氨醯-tRNA合成酶基因，則轉基因病毒便可以在特殊的細胞環境內，啟動UAG密碼子，並利用非天然胺基酸合成蛋白質、完成複製。

特殊細胞株培養複製缺陷型病毒（圖片來源：周德敏課題組）

我們耗費兩年時間才成功培養出特殊細胞系，這恰恰是實現密碼子擴展技術的關鍵步驟，也是我們能夠大規模製備這種複製缺陷型病毒的核心技術。經過最初的環境適應，這種細胞系目前長勢良好。作為完美的病毒包裝載體，這個特殊細胞系具有重大的理論研究價值，我們還將探索其基因組、轉錄組測序特徵，研究基因修飾細胞與正常生物體細胞之間的區別。

Q：基因密碼子擴展技術在您研究的其他方向中，還有哪些重要的應用？

周德敏教授：地球上絕大多數生物體內的蛋白質翻譯過程，由61個密碼子和3個終止密碼子執行，其中61個密碼子產生20種天然胺基酸，並組成無數種不同的蛋白質。密碼子擴展技術，旨在將生物體內閒置的終止密碼子變身為有義密碼子，從而讓生物體合成出含有更多種類胺基酸的蛋白。非天然胺基酸最重要的作用是實現蛋白質定點修飾和標記。天然蛋白質由20種胺基酸進行排列組合，但能進行化學交聯反應的胺基酸種類卻很少，常用的結合位點為賴氨酸。多數蛋白質含有多個賴氨酸位點，如果需要對蛋白質進行偶聯，則修飾物/標記物可能會被隨機結合在任意一個賴氨酸位點。若某個蛋白質包含具有特殊反應活性的非天然胺基酸，則偶聯反應會發生在特定胺基酸位點，從而實現可控的精準修飾。

我們利用這一技術已實現腺相關病毒（AAV）的非天然胺基酸定點標記及靶向修飾，有望催生新一代的靶向基因療法。AAV病毒宿主範圍廣、病原性低、攜帶的治療基因表達期長，是基因療法常用的轉染載體之一。利用非天然胺基酸標記方法，可以進一步提升AAV病毒的細胞特異性、減少其對靶細胞之外的感染風險，從而提升轉染效率。我們還是將終止密碼子引入AAV病毒，並讓其在模式細胞中表達出包含非天然胺基酸的蛋白質，從而使蛋白質可以定點定量引入多種修飾分子。

AAV病毒生命周期（圖片來源：美國微生物協會網站）

我們選擇腦膠質瘤為該療法研究對象，通過讓AAV病毒載體表達出環形RGD（精氨醯-甘氨醯-天冬氨酸）分子，引導病毒靶向整合素高表達的腦膠質瘤細胞。另外AAV病毒基因組還整合了HSV-TK（單純皰疹病毒胸苷激酶）自殺基因，所以這種療法大大提升了靶向殺傷腦膠質瘤細胞的能力。目前細胞實驗階段已經結束，我們將在下一階段啟動動物實驗模型。

整合酶基因裂變：愛滋病疫苗研發的新靶標

Q：您目前在研的疫苗主要覆蓋哪些疾病？未來您的團隊還有哪些具體的研究發展方向？

周德敏教授：在疫苗研究領域，我目前主要是研發弱流感疫苗以預防其他重型流感，之後我們還會繼續開發H1N1、H3N2、H5N1、H7N8型流感疫苗。除此之外，我們還會利用同樣的方式研發EV71型手足口病、非典、伊波拉病毒疫苗。這些都是游離複製型病毒的疫苗，即病毒基因組以游離質粒方式自行複製，而不整合入宿主細胞基因組。

同時我們也已經啟動了針對整合型病毒疫苗的研製，整合型病毒包括HIV等逆轉錄病毒。而HBV（B肝病毒）、HPV（人乳頭瘤病毒）等既可以游離態複製，也可整合到宿主細胞基因組並導致高危的癌變風險。這類病毒疫苗研發的靶標，是病毒整合入宿主基因組所需要的整合酶：我們在整合酶蛋白基因編碼的特殊位點加上終止密碼子，則整合酶無法翻譯表達，這類病毒便無法整合進入宿主基因組，從而杜絕疫苗在人體內導致感染的風險。儘管這類病毒突變速率較快，但我們相信依據游離複製型疫苗的研發經驗，我們有希望找到重大疾病的有效預防手段。

引起愛滋病的HIV通過整合酶，進入人體細胞基因組（圖片來源：美國衛生部網站）

Q：在多年的學習和科研過程中，您有幸遇到國內外名師的指導。在科學精神的傳承中，您有哪些特別的感觸？

周德敏教授：我在國內的研究生課程中師承張禮和院士，學習藥物全合成和天然產物合成。但老師站得高看得遠，他很早就認識到生物製藥發展的潛力，所以建議我進行日語培訓。之後我有幸前往日本接受博士聯合培養計劃，並學習分子生物學。在日本我的進步很快，將生物和化學的界限打通，許多曾經困擾自己的問題豁然開朗，在1年半的時間裡就在《JACS》、《PNAS》雜誌上發表了好幾篇重要論文。

正是有了跨界的知識積累，幫助我將不同領域的新技術組合，然後再產生自己的原創性突破。突破需要找到方法，更需要有敢於突破的勇氣。面對失敗的實驗，不應該氣餒或質疑自己，而應當堅持創新的想法，並且在失敗中看到機遇。也許前人也遇到過同樣的失敗，卻沒有從中汲取成功的靈感，所以我們應當珍惜這樣反敗為勝的機遇。回國之前我曾在藥企工作，負責過一個shRNA文庫建設項目，當時我發現依據某一權威論文的數據進行實驗卻反覆出現問題，我並未因無法重複權威實驗而氣餒，相反經過長時間實驗和反覆推敲，發現這篇論文中的關鍵環節錯誤，之後也有其他學者發表糾錯論文證實了自己的想法。所以只要堅持對基礎科學深入研究，一定能從失敗中找到原因並產生新的發現。

周德敏教授課題組（從左到右）：徐歡、司龍龍、周德敏教授、張禮和院士

優秀的老師教會我如何做人、做科研，而今作為博導和院系主管，我也希望將科研精神傳承下去。另外我認為在實驗課題的推進過程不能急功近利，3-5年的時間很正常；而對研究生的培養也不局限於傳授知識，而是要給予同學們充分的主動權；和年輕學生在一起工作，我會讓自己保持開放的心態，而不是墨守陳規，這樣才能發揮名校優秀學生的聰明才智，讓整個團隊在攻克科學難題的道路上不斷實現新的突破，為人類健康帶來更多福祉。

原標題：基因密碼神來之筆，重磅流感活疫苗誕生記——專訪北大藥學院長周德敏教授