生命科學研究中，生物結構的精確鑑定和超微結構定位是闡明其如何調控生物學功能的關鍵步驟，因此納米尺度的多目標識別對於了解生物分子如何調節生命活動至關重要。電子顯微鏡（EM）能夠提供細胞超微結構的納米級解析度圖像，但是對電鏡圖像進行數據分析時根據其灰度值進行區分解釋，容易受到視覺或主觀因素影響帶來誤差，對於大批量數據中的罕見事件更容易忽略。為了精確標記，電鏡觀察中可以使用電子探針，但是這些基因編輯的或免疫靶向的探針僅限於三個靶標；光電聯用技術，可以對電鏡觀察進行螢光引導分析，但是在EM樣品製備過程中的螢光保留在技術上具有挑戰性，並且將螢光信號拉大疊加在電鏡圖像上，通常沒有納米級解析度，並且僅限於少數目標的可視化。而元素分析配件與電鏡的結合可以為生命科學的研究提供一個強大的精確標記的納米級有色工具「color-EM」。
電鏡中常用的元素分析方法包括X射線能譜（Energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS）、電子能量損失譜（Electron energy-loss spectroscopy, EELS）、和陰極發光(cathodoluminescence，CL) 等。EDS是微區成分分析最為常用的一種方法，其物理基礎是基於樣品的特徵 X 射線；EELS的物理基礎是基於電子束穿透樣本時，與樣品發生非彈性相互作用，得到的電子能量損失譜；CL的物理基礎是樣本在電子束的轟擊下產生的發光現象。
圖1 EDS、EELS和CL 物理原理圖[1]
a.當樣品K層電子被入射電子激發或電離時，會在K層產生一個空缺，為了填補不穩定的空缺，L層中的電子下降，從而釋放出具有一定能量的特徵 X 射線，EDS（也稱為EDX）則通過收集這些特徵X射線進行元素分析；入射電子穿透樣品時，與樣品發生非彈性相互作用，電子將損失一部分能量。如果對出射電子按其損失的能量進行統計計數，便得到電子的能量損失譜（EELS）。b. EM，EDS和EELS的顯微鏡結構示意圖,EELS必須位於樣品的透射側，EDS一般位於上側位。c. 在電子束照射下，一些分子和納米粒子會在可見光譜範圍內發光。CL的作用機理是與發光分子或粒子的相互作用，利用電子束的光柵掃描，記錄每個發光的位置，從而在EM圖像提供光子發射定位。d. CL的電子顯微鏡結構示意圖。
元素分析結果往往一目了然，極具說服力，廣泛的應用於無機或有機固體材料分析；金屬材料的相分析、成分分析和夾雜物形態成分的鑑定；以及固體材料的表面塗層、鍍層分析，如：金屬化膜表面鍍層的檢測；金銀飾品、寶石首飾的鑑別，考古和文物鑑定，以及刑偵鑑定等領域；那麼在生命科學的研究中有哪些作用呢？本期先給大家分享幾個EDS在生命科學研究中的案例。
電子顯微鏡的納米解析度解開了細胞的複雜性，但是大分子的功能性解釋和含量卻因其黑白色的圖片而受到阻礙。該研究以1型糖尿病大鼠模型的胰腺為研究對象，在電鏡觀察的而基礎上，輔以EDS分析，不僅能夠以高解析度識別細胞器和生物分子標記，同時也發現不同的顆粒具有典型的元素分布。根據傳統電鏡的視覺灰度分析，只能識別出α、β和δ細胞，而EDS分析則揭示了這三種細胞所含N、P、S的含量不同，同時也可以通過對元素含量的檢測鑑定細胞和顆粒[2]。
由金屬磨損顆粒引起的局部組織不良反應（ALTR）而導致的手術失敗率增加是全髖關節置換術中的重要臨床問題。該研究通過常規的組織學檢查、電鏡觀察、EDS等技術研究了三大類髖關節植入物，金屬對金屬的髖關節置換術（MoM HRA）、大頭全髖關節置換術（MoM LHTHA）和非金屬對金屬雙模塊頸部全髖關節置換術（Non-MoM DMNTHA）引起ALTR的嚴重程度。上圖通過EDS分析顯示了進入組織的碎片的元素分布圖，通過元素分布可以判斷進入組織的碎片來自哪一部分，從而可以優化植入件[3]。
FAM20A基因突變可導致釉質腎症候群（ERS）與成釉不全（AI）、腎鈣質沉著症、牙齦纖維瘤病和牙菌病相關。FAM20A可控制釉質肽的磷酸化，從而影響釉質礦化。本文採用掃描電子顯微鏡（SEM）、能譜儀（EDS）、X射線衍射儀（XRD）和X射線螢光（XRF）對ERS患者和健康人未破裂牙釉質的結構和化學成分進行表徵。上圖為正常牙釉質（圖A-D）和ERS牙釉質（圖E-H）中磷、鈣和氧的能譜圖，結果顯示健全的釉質中，P和Ca的含量高於牙本質。這一結果強調了健全牙釉質的高度礦化。相比之下，ERS患者的牙釉質和牙本質之間沒有這種差異（圖E-H），顯示出ERS中釉質礦化減少[4]。
EDS目前尚未廣泛的應用於生命科學的研究中，僅在生命體的結晶體組織 如、牙齒、骨頭等的研究中應用較多，下面分享幾張EDS的圖片，以期能夠為大家的研究提供一些思路。
圖2 葉柄橫截面的SEM-EDS元素分布圖[5]
圖3 SEM-EDS分析顯示冬青樹葉的表面硫（粉紅色）和矽（藍色）的汙染[6]
圖4 該圖顯示整個小麥種子從微米級到毫米級的化學成分[7]
圖5 Au核-Ag殼納米顆粒EDS分析圖譜：元素圖顯示了被Ag殼包圍的Au核[8]
參考文獻：
1. Pirozzi, N.M., Hoogenboom, J.P. & Giepmans, B.N.G. ColorEM: analytical electron microscopy for element-guided identification and imaging of the building blocks of life. Histochem Cell Biol 150, 509–520 (2018).
2. Marijke Scotuzzi , Jeroen Kuipers , Dasha I Wensveen,et al. Multi-color electron microscopy by element-guided identification of cells, organelles and molecules. Sci Rep. 2017 Apr 7;7:45970
3. Zhidao Xia , Benjamin F Ricciardi , Zhao Liu, et al. Nano-analyses of wear particles from metal-on-metal and non-metal-on-metal dual modular neck hip arthroplasty. Nanomedicine. 2017 Apr;13(3):1205-1217
4. Guilhem Lignon , Fleur Beres , Mickael Quentric,et al. FAM20A Gene Mutation: Amelogenesis or Ectopic Mineralization? Front Physiol. 2017 May 3;8:267
5. Vidiro Gei，Peter D. Erskine，Hugh H Harris，et al. Tools for the Discovery of Hyperaccumulator Plant Species and Understanding Their Ecophysiology. Jan 2018: 117-133
6. https://nano.oxinst.com/library/blog/biological-eds-tips-and-tricks
7. Collins C. L.1, McCarthy C.1, Rowlands From millimetres to microns with large area EDS mapping on biological samples
8. https://sites.northwestern.edu/shynespotlight/2017/03/17/hitachi-hd-2300-dual-eds-cryo-stem/
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