N6 - 甲基腺苷（m6A）
圖丨 mRNA 修飾途徑方法（來源：Cell）
早在 20 世紀 70 年代，科學家們就在 RNA 中發現了 m6A 修飾，但一直由於技術制約其功能未能被很好的揭示。直到 2012 年，科學家們的研究表明，m6A 修飾和 mRNA 的穩定性、剪接加工、翻譯以及 microRNA 的加工有關。此外，m6A 還和幹細胞命運、生物節律相關，可以促使幹細胞從自我更新狀態轉向細胞分化，研究人員發現，甲基化會縮短 mRNA 的半衰期，減少其豐度。可以說，m6A 修飾幾乎影響 RNA 代謝的每個步驟。
mRNA 中 m6A 修飾研究雖然已經取得了實質性進展，但仍然存在一些技術挑戰和基礎科學問題。第一，目前在轉錄組範圍內檢測 m6A 的方法主要依賴於 m6 A 抗體富集，與其質量密切相關，抗 體選擇不當將造成假陽性；第二，MeRIP-Seq（RNA 甲基化測序）方法只能將 m6A 殘基定位在 100~200nt（nucleotide，nt 指核苷酸）的轉錄本區域中，無法在全轉錄組水平上鑑定 m6A 的精確位置；第三，其它 RNA 結合蛋白免疫沉澱方法一樣，對於一些小樣本或珍貴樣品不適用；第四，為什麼 m6A 甲基化酶只對一些 mRNA 起作用而不是全部，是否還存在其它甲基化相關酶以及這些酶之間是如何協調作用的？第五，其它 RNA 修飾與 m6A 之間是否存在聯繫，它們是否一起調節某種轉錄物的生物學過程？這些問題仍有待進一步研究。
2'-O - 甲基化（Nm）
關於 5'帽子的 2'-O- 甲基化修飾（Nm），一般認為 5'帽子可以促使 mRNA 和核糖體的結合，能有效地封閉 RNA 5'末端，以保護 mRNA 免疫 5'核酸外切酶的降解，增強 mRNA 的穩定性。此外，5'帽子還參加 mRNA 前體的剪接，參與 mRNA 3'末端多聚腺苷酸化，mRNA 從核中到細胞質中的運輸也需要 5' 帽子的參與。
1998 年，Wei 等發現帽結合蛋白（cap binding protein，CBP）可以與 ploy(A)綁定蛋白 (PABP) 相互作用，拉近了 5'帽子與 ploy(A) 尾的距離，形成的環狀結構可以加強帽結構與 CBP 的 親和力，加快核糖體的循環，從而提高翻譯效率。(圖 A)
圖丨 5'帽子的功能示意圖（來源：生命科學）
2010 年，Daffis 等發現病毒 RNA 5'帽子的 2'-O - 甲基化修飾可以使其逃脫宿主的抗病毒應答，細胞質 RNA 5'帽子的 2'-O - 甲基化修飾可能是宿主區分自身 RNA 和外來 RNA 的一個重要標識。哺乳動物細胞對 5'帽子沒有 2'-O - 甲基化修飾的病毒具有天然的免疫，因為 IFIT1(interferon-induced protein with tetratricopetide repeats 1，幹擾素誘導的四肽重複蛋白 1） 可以與這類病毒 mRNA 結合，使其不能被翻譯。（圖 B）
假尿嘧啶（ψ）
假尿嘧啶修飾是最豐富的 RNA 修飾，一般由尿苷的異構化產生，已有的研究表明，mRNA 的假尿嘧啶化修飾主要有三個功能：改變密碼子、增強轉錄本穩定性和應激反應應答。mRNA 假尿嘧啶化修飾的過程是由假尿嘧啶合成酶（pseudouridine synthases，PUS）進行催化，讓尿嘧啶核苷酸（U）化學結構發生改變，形成假尿嘧啶核苷酸。之前研究已在 tRNA、rRNA、snRNA 中發現了大量的假尿嘧啶，最近的研究證實假尿嘧啶同樣存在於 mRNA 中。
2011 年，Karijolich 等發現，mRNA 上的假尿嘧啶化修飾可以改變密碼子。將酵母中的密碼子中的尿嘧啶 (U) 替換為假尿嘧啶，這些密碼子就能編碼胺基酸，2014 年，Schwartz 等發現，酵母發生熱休克時，會由 Pus7p（一種蛋白） 額外引入超過 200 個假尿嘧啶修飾位點，如果敲除 PUS7 基因，則那些含有新引入修飾的 mRNA 會減少，這說明著假尿嘧啶修飾可能會增強轉錄本穩定性。
雖然以上三種修飾已被廣泛應用於 mRNA 藥物的生產過程中，但關於 mRNA 修飾點位的探究才剛剛開始，檢測技術的局限性仍有待突破。ψ-seq 和 RiboMeth-seq （兩種測序技術）對假尿嘧啶化修飾和 2'-O - 核糖甲基化修飾位點的定位可以達到單核苷酸的精度，但對 m6A 位點的定位精度還不夠高。
此外，還有很多 RNA 修飾缺乏相應的技術手段去深入研究。因此，在技術方面還需要有更多的 「NGS+」 型(傳統檢測手段與高通量測序相結合)的高通量技術產生。最近，納米孔技術是一種新穎的單分子方法，已顯示對 m6A 的單鹼基解析度檢測，科學家認為，這種單分子方法可能會成為一種新穎的範例，可以同時檢測不同的 RNA 修飾。