張銳組揭示一個新的mRNA m5C修飾writer蛋白

責編丨迦漵

mRNA修飾是一類新近發現的真核生物重要的轉錄和轉錄後調控機制，目前已報導數種mRNA修飾。mRNA修飾在細胞分化、發育、衰老和腫瘤等已知生物學過程中都起到重要的調控作用。該領域一個有趣的發現是幾乎所有mRNA修飾的writer蛋白都存在多種類型的RNA底物。比如METTL16介導snRNA和mRNA的修飾，TRMT6/TRMT61A介導tRNA和mRNA的修飾，PUS家族蛋白介導tRNA和mRNA的修飾。因此一個很引人入目的假說是大多數mRNA修飾writer蛋白最開始的底物可能都是非編碼RNA。在物種進化過程中，一些mRNA序列模擬了其非編碼RNA底物的序列和結構特徵，被加上了修飾。當mRNA上的修飾逐漸產生生物學功能，使物種有了更好的適應度，其writer蛋白開始和多種RNA底物共同進化，進而有了同一writer蛋白多種RNA底物共存的狀態。

m5C修飾是一種真核生物中廣泛分布的RNA修飾。近幾年的研究發現tRNA、rRNA和mRNA上都存在m5C修飾。由於之前基於高通量測序的單鹼基m5C鑑定技術容易造成假陽性現象，這一領域一直存在爭議 【1】。2019年中山大學張銳課題組建立了一套全轉錄組水平高置信度鑑定mRNA m5C甲基化的技術，通過這一技術構建了哺乳動物細胞系與組織的mRNA m5C精確圖譜，並發現mRNA存在兩類m5C位點(命名為Type I和Type II 位點)，分別據有獨特的序列和結構特徵 【2】。Type I 位點在大多數組織和細胞類型中富集，位於一個莖-環結構的5』端，並且位點3』端有一個富含鳥嘌呤（G-rich）的基序。Type I位點的writer蛋白為NSUN2，一個同時可以介導tRNA TΨC環 5』端 m5C甲基化的writer蛋白。Type II位點具有較強的組織特異性，佔比從1%-40%不等。Type II位點位於一個莖-環結構的環區，並且位點3』端帶有一個TCCA基序。Type II位點的writer蛋白未知。

近日，張銳課題組在National Science Review上發表了題為Sequence- and structure-selective mRNA m5C methylation by NSUN6 in animals的研究，發現了Type II位點的writer蛋白NSUN6。

通過哺乳動物多個組織Type II位點數目和所有已知甲基化轉移酶表達的相關性分析，作者意外的發現NSUN6，一個特異的甲基化tRNA-Thr 和 tRNA-Cys 接收莖的甲基轉移酶，跟Type II 位點數目有強相關性。CRISPR/Cas9敲除NSUN6後，Type II位點消失；而外源引入NSUN6可以使Type II位點甲基化水平恢復。作者進一步結合miCLIP（methylation miCLIP）數據分析確定NSUN6特異性的結合Type II位點區域。這些證據證實NSUN6為特異的Type II 位點writer蛋白。為了進一步研究Type II底物的序列特徵，作者構建了一個高通量甲基化水平報告系統進行數千種人工突變引入。通過這一系統揭示NSUN6對TCCA基序的改變十分敏感，而附近鹼基組成和結構特徵可以調控NSUN6對Type II位點的催化水平。通過polysome BS-seq和報告基因等實驗，作者發現Type II m5C有可能涉及到mRNA翻譯的調控。

作者的這些發現揭示，就如其他mRNA修飾，mRNA上兩類m5C的writer蛋白都是共同靶向多種底物（tRNA和mRNA）。這一特點也帶來了mRNA修飾領域一個重點和難點問題，即如何特定的揭示比如mRNA修飾的功能。為解決這一問題，作者以NSUN6為例構建了一個研究框架：1. 結合tRNA和mRNA底物的序列結構特徵和之前發表的NSUN6-tRNA複合物晶體結構 【3】，通過Rosetta比較模型和RNP-denovo算法，模擬NSUN6-tRNA和NSUN6-mRNA的結合模型。2. 通過模型揭示NSUN6 可能的分別跟tRNA和mRNA相互作用的關鍵位點。3. 通過在NSUN6蛋白特定位點引入點突變，發現可能只識別單一底物(mRNA)的突變體蛋白。這一研究框架可以在將來用於所有多種類型底物writer蛋白的功能研究，揭示特定RNA底物修飾的功能，為mRNA修飾的研究開闢了嶄新的思路。

圖示：NSUN6介導的Type II mRNA m5C的序列特徵以及NSUN6-tRNA/mRNA複合物模擬

揭示特定類型mRNA修飾的writer蛋白是研究mRNA修飾功能的基礎和最重要的科學問題之一，伴隨而來的是激烈的學術競爭。NSUN6作為mRNA Type II m5C位點的writer蛋白同時被國際上其他兩個課題組獨立發現，並投稿在末發表預印本伺服器BioRxiv 【4-5】。

據悉，中山大學生命科學學院張銳教授、博士後黃濤為本文的共同通訊作者，劉健恆、黃濤、張鈺森、趙天璇為本文的並列第一作者，趙雪泥、陳婉穎也對本工作做出重要貢獻。

原文連結：

http://dx.doi.org/10.1093/nsr/nwaa273

參考文獻

1. Trixl L. & Lusser A. (2019) Getting a hold on cytosine methylation in mRNA.Nature Structural & Molecular Biology, 26, 339–340

2. Huang T. et al. (2019) Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural & Molecular Biology, 26, 380-388

3. Liu R.J. et al (2017) Structural basis for substrate binding and catalytic mechanism of a human RNA:m5C methyltransferase NSun6. Nucleic Acids Res, 45:6684-6697

4. Selmi T. et al. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.01.320036v1

5. Fang L. et al. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.03.324715v1