CRISPR RNA介導的整合酶可對細菌基因組實現高效多重操作

2020-11-26 科學網

CRISPR RNA介導的整合酶可對細菌基因組實現高效多重操作

作者：

小柯機器人

發布時間：2020/11/24 17:01:11

美國哥倫比亞大學Samuel H. Sternberg研究小組取得一項新突破。他們發現CRISPR RNA介導的整合酶可實現高效、多重細菌基因組操作。 該項研究成果發表在2020年11月23日出版的《自然-生物技術》上。

為了解決現有細菌基因組特異性整合的缺點，研究人員研發了基於先前報導的霍亂弧菌Tn7樣轉座子的顯著改進版本，該轉座子使用I-F CRISPR–Cas系統進行可編程的、RNA引導的轉座。引導RNA輔助靶向（INTEGRATE）系統優化了轉座因子的插入效率，在細菌中以約100％的效率實現了高達10 KB鹼基高度準確且無標記的DNA整合。使用多間隔CRISPR陣列，研究人員通過結合正交整合和重組酶，在三個基因組位點中實現了同時多重插入和高效的多位點缺失。

最後，研究人員證明了其在生物醫學和工業相關細菌中的強大功能，並在複雜細菌群落中實現了針對靶點和物種的整合。這項工作揭示了INTEGRATE可作為多用途、千鹼基規模因組工程改造的多功能性工具。

據悉，現有特異性整合細菌中千鹼基DNA序列的技術受到效率低下、依賴重組效率、對多種載體需求以及多重挑戰的局限。

附：英文原文

Title: CRISPR RNA-guided integrases for high-efficiency, multiplexed bacterial genome engineering

Author: Phuc Leo H. Vo, Carlotta Ronda, Sanne E. Klompe, Ethan E. Chen, Christopher Acree, Harris H. Wang, Samuel H. Sternberg

Issue&Volume: 2020-11-23

Abstract: Existing technologies for site-specific integration of kilobase-sized DNA sequences in bacteria are limited by low efficiency, a reliance on recombination, the need for multiple vectors, and challenges in multiplexing. To address these shortcomings, we introduce a substantially improved version of our previously reported Tn7-like transposon from Vibrio cholerae, which uses a Type I-F CRISPR–Cas system for programmable, RNA-guided transposition. The optimized insertion of transposable elements by guide RNA–assisted targeting (INTEGRATE) system achieves highly accurate and marker-free DNA integration of up to 10 kilobases at ~100% efficiency in bacteria. Using multi-spacer CRISPR arrays, we achieved simultaneous multiplexed insertions in three genomic loci and facile, multi-loci deletions by combining orthogonal integrases and recombinases. Finally, we demonstrated robust function in biomedically and industrially relevant bacteria and achieved target- and species-specific integration in a complex bacterial community. This work establishes INTEGRATE as a versatile tool for multiplexed, kilobase-scale genome engineering.

DOI: 10.1038/s41587-020-00745-y

Source: https://www.nature.com/articles/s41587-020-00745-y

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