近日，麻薩諸塞大學醫學院高光坪團隊與麻省理工學院張鋒在國際頂級期刊CELL上發表綜述，題為「CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors」。文章指出了基於CRISPR利用腺相關病毒（AAV）載體遞送，在人體內編輯基因治療疾病的策略，深入討論了CRISPR治療廣泛應用所面臨的挑戰，以及持續的研究和技術進步給該領域帶來的革命性突破。
CRISPR技術作為新興的基因編輯工具，極大推動了基礎研究和疾病治療，將CRISPR/Cas直接用於人體，為多種疾病的治療提供了希望。儘管CRISPR工具箱能夠實現從DNA到RNA、從編輯到基因表達調控的多種操作，遞送始終是一個問題。目前，腺相關病毒載體是體內基因治療遞送的主要平臺。AAV安全、便捷，能夠將單鏈DNA載體基因組遞送至各種組織和細胞類型，並且在多種給藥方式中僅具有弱免疫原性。儘管載體基因組在宿主細胞內基本上保持游離狀態，但通過多聯體和環化可以穩定基因組以介導分裂後細胞中的長期轉基因表達，從而產生持久的治療效果。AAV載體在向疾病動物模型和患者遞送基因療法方面已取得成功，推動了它們用於體內遞送CRISPR療法。
傳統的CRISPR基因編輯通過Cas蛋白引發雙鏈斷裂，進而通過非末端連接實現基因沉默，或根據預測的插入缺失進行校正，通過同源重組系統精確突變。通過將CRISPR系統與腺病毒載體結合，腺病毒載體可以整合用於同源重組介導基因插入、同源重組獨立的靶基因插入等元件，實現靶向基因校正；腺病毒載體也可以通過向特定組織遞送Cas蛋白，一對靶點獨立的sgRNA，可以實現大片段基因切除；攜帶Cas13的AAV載體可以通過靶向RNA實現持久的體內治療效果。
此外，改造CRISPR/Cas系統，通過Cas蛋白突變體與效應蛋白偶聯，實現特定基因的表達調控。通過腺病毒載體承載dCas9-KRAB/dCas9-VP64可以分別實現轉錄水平的下調、增強；通過遞送dCas蛋白結合組蛋白修飾酶、DNA(去)甲基化酶實現表觀遺傳水平的調節；腺病毒載體也可能與base editor、prime editor結合發揮精確基因編輯的功能。
AAV可用於離體遞送，目前離體遞送技術已相對成熟，在將編輯的細胞回輸患者體內前，可以確保基因編輯的效率和準確性，安全性高，且不受宿主免疫限制。然而易於分離、操作的細胞類型有限，體內編輯具有更廣泛的應用。AAV載體已被廣泛用於體內基因治療遞送，在關於疾病模型許多研究中已經報導了使用AAV進行基於CRISPR的基因組編輯治療的體內遞送，安全性較高，關鍵的問題在於包裝CRISPR大小限制以及脫靶效應。為減小CRISPR/Cas系統的大小，便於腺病毒承載，可以選擇相對較小的Cas蛋白，採用雙重腺病毒載體分別攜帶CRISPR/Cas不同基因片段，或者通過內含肽分開在蛋白質水平上重建。而為了降低脫靶效應，可以藉助誘導表達系統、自切割AAV-CRISPR系統、局限特定組織空間、特定位點AAV載體整合。
CRISPR-腺病毒系統依然面臨許多問題，例如針對AAV衣殼和載體誘導的免疫應答的預先存在的免疫力，遞送效率和特異性，以及AAV載體的生產等，同時脫靶效應、過度的靶向效應、基因重排等也限制了該系統的應用，但是隨著我們對細胞過程的深入了解，以及各類新技術的發展，將使我們更好應用CRISPR/AAV系統，治療各類疾病。
以CRISPR/Cas為前沿的生物化學領域與AAV載體病毒學領域的共同發展，將更好服務於新興的分子療法。
本期編輯：Reynard Fox