Cas9 nickase和CRISPR RNA骨架介導的植物多重正交基因組編輯系統

2020-12-05 施普林格自然OA

原文以 SWISS: multiplexed orthogonal genome editing in plants with a Cas9 nickase and engineered CRISPR RNA scaffolds 為標題發布在 Genome Biology 期刊

CRISPR/Cas9系統已經被打建成一個超級的分子工具箱。來自釀膿鏈球菌（Streptococcuspyogenes）的Cas9蛋白由RuvC和HNH兩個核酸酶結構域組成，分別切割非靶向鏈和靶向鏈。通過突變第10位的天冬氨酸(Asp10)和/或第840位的組氨酸（His840），Cas9便成為一個切口酶nCas9或失去核酸酶活性的dCas9。Cas9用來在基因組上產生DNA雙鏈斷裂（Double Strand Break, DSB）；成對的nCas9也可以用於在基因組上產生DSB，nCas9 (D10A)還被用於胞嘧啶鹼基編輯系統（Cytosine Base Editor, CBE）和腺嘌呤鹼基編輯系統（Adenine Base Editor, ABE）的開發；dCas9常被用於融合各種效應蛋白進而實現CRISPR介導的基因轉錄激活（CRISPR Activation, CRISPRa）、基因轉錄抑制（CRISPR Interference, CRISPRi）、基因組成像以及表觀遺傳修飾等。但是，將CRISPR/Cas9系統及其衍生技術系統應用於多重編輯時，往往只能執行一種類型的基因組編輯事件。

目前，已經開發多重正交的基因組編輯策略主要包括以下幾個方面：一種策略是利用截短的sgRNA控制Cas蛋白核酸酶活性來調控基因的表達，同時利用全長的sgRNA在另一位點進行基因敲除；第二種策略是將RNA配體的髮夾結構整合到sgRNA骨架上，形成支架RNA（Scaffold RNA, scRNA），dCas9/scRNA複合體通過髮夾結構招募基因激活或抑制因子，在不同的位點同時實現基因轉錄激活和抑制的雙重功能；第三種策略是使用多個同源的CRISPR系統在不同的靶位點同時實現基因激活、抑制和刪除三重功能。這些基因組工程的多重策略多是在細菌、酵母和人類細胞中開發的，可用於產生不同編輯類型的植物多重基因組編輯系統的報導仍比較少。

與Cas9和dCas9相比，nCas9在多重基因組編輯上的潛力並沒有完全開發出來。由於CBE和ABE都使用相同的nCas9 （D10A），因此，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞課題組近期在開放獲取期刊Genome Biology 上發表了基於一個nCas9核酸酶的多重正交基因組編輯系統，並命名該系統為單系統產生的同時多重編輯系統（Simultaneous and Wide-editing Induced by aSingle System, SWISS）。SWISS利用兩個含有不同RNA配體的RNA scaffold （scRNA）分別招募相應結合蛋白融合的胞嘧啶脫氨酶或腺嘌呤脫氨酶，同時在不同的靶位點分別實現CBE和ABE兩種鹼基編輯。再利用nCas9的切口酶活性，將成對的sgRNA引入到SWISS系統中，可以在第三個靶位點處產生DSB，使得SWISS成為具有三重（C-to-T、A-to-G和Knock out）編輯功能的CRISPR系統。高彩霞研究組博士生李超為本文第一作者，高彩霞研究員和王延鵬青年研究員為共同通訊作者。

圖：SWISSv3介導的CBE、ABE和Knock out三重編輯活性

上：SWISSv3策略示意圖；下：水稻原生質體中測試的兩組靶位點

研究者首先對RNA配體招募的CBE和ABE鹼基編輯載體進行了優化，進一步使用報告系統對分別用於介導CBE和ABE鹼基編輯功能的高效scRNA進行了高通量的篩選，並用水稻內源靶位點對候選scRNA進行了驗證。最終選擇了具有3端RNA配體的esgRNA-2×MS2和esgRNA-2×boxB，分別用於介導的CBE和ABE的鹼基編輯功能。開發的SWISSv1.1用於實現C-to-T和Knock out雙重功能編輯；SWISSv1.2用於實現A-to-G和Knock out雙重功能編輯。在SWISSv2中同時表達胞嘧啶脫氨酶模塊和腺嘌呤脫氨酶模塊，實現C-to-T和A-to-G雙重功能編輯；在SWISSv2中引入成對的sgRNA，成為SWISSv3，實現C-to-T、A-to-G和Knock out三重功能編輯(圖)。並且，使用Cas9的PAM變體Cas9-NG進一步拓展了SWISS系統在基因組上的靶序列選擇。在水稻植株中，SWISSv3在水稻植株中同時產生三種編輯事件的效率為7.3%。

SWISS技術體系的建立，有望用於植物分子設計育種、基因性狀疊加和調控通路的改變等。此外，本研究中使用正交的RNA配體-結合蛋白對，如MS2-MCP、PP7-PCP、boxB-N22p、Com-com，進一步擴展了用於植物合成生物學研究的工具箱，有利於在植物體內執行綜合的信號通路、基因通路以及生物傳感器的控制研究。

Genome Biology

doi:10.1186/s13059-020-02051-x

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