遺傳發育所在CRISPR-Cas9玉米基因組編輯方法研究中取得進展

2021-01-13 中國科學院
遺傳發育所在CRISPR-Cas9玉米基因組編輯方法研究中取得進展

2018-04-04 遺傳與發育生物學研究所

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　　基因組編輯是生命科學新興的技術並被迅速在每個實驗室應用，特別是基於CRISPR-Cas9系統的基因編輯工具近年來發展較快，在醫療、農業等領域展現出巨大的應用潛力。然而此前，在玉米等部分作物中基於農桿菌轉化的載體進行基因組編輯的效率偏低，在一定程度上影響到該技術的高效利用尤其是基於CRISPR-cas9系統的高通量突變allele篩選。因此，如何提高編輯效率是大家關注的問題。另一個非常關鍵的問題是如何降低脫靶或不脫靶，這也是實際應用的限制因素。

　　中國科學院遺傳與發育生物學研究所韓方普實驗室前期選擇了若干玉米減數分裂特異基因的啟動子用於驅動Cas9基因的表達，希望在配子中實現高效的基因組編輯，從而在T1代獲得大量純合或雙等位的突變體。其中用到的一個為玉米DMC1基因啟動子，構建了DPC（DMC1 promoter-controlled）CRISPR-Cas9載體系統，用該載體系統轉化玉米幼胚後，結果意外發現：凡是抗性愈傷組織靶位點均發生基因組編輯，另一個非常有趣的結果是：T0代植株中出現60-70%左右的純合或雙等位的突變體，其餘為雜合或嵌合的突變體植株。並且這些純合或雙等位突變體植株(再生自一個抗性愈傷組織)含有不同的突變allele類型。通過對多個基因靶點（包括一個標記基因zb7，突變能產生白化的表型）的編輯實驗，驗證了該載體系統的高效性（下圖為對玉米zb7基因靶點的編輯）。這一技術為韓方普研究組研究細胞分裂突變體的基因功能提供了非常快速高效的方法，當代純合或嵌合突變體就可以直接觀察細胞學及染色體行為與功能。此外，也證實了產生的突變能夠穩定遺傳到T1代，並且新的突變allele類型在T1代也被發現。通過全基因組測序分析，在預測的1000多個潛在脫靶位點沒有發現脫靶突變。由於DMC1基因在進化中非常保守，該基因的啟動子也可能有潛力在別的植物中發揮類似的作用，雖然科學家在小麥中的初步嘗試結果不甚理想。

　　該研究成果於3月23日在線發表於Plant Biotechnology Journal 雜誌上（DOI:10.1111/pbi.12920）。韓方普研究組博士生馮超為該論文的第一作者，該研究得到轉基因重大專項及科技部育種專項的資助。

 

　　圖：利用DPC CRISPR/Cas9系統編輯玉米zb7基因。A. zb7基因結構、靶位點和DPC CRISPR/Cas9 載體模式圖； B. 編輯zb7基因獲得的T0代植株表型； C. 部分T0代突變植株基因型鑑定的結果。

　　基因組編輯是生命科學新興的技術並被迅速在每個實驗室應用，特別是基於CRISPR-Cas9系統的基因編輯工具近年來發展較快，在醫療、農業等領域展現出巨大的應用潛力。然而此前，在玉米等部分作物中基於農桿菌轉化的載體進行基因組編輯的效率偏低，在一定程度上影響到該技術的高效利用尤其是基於CRISPR-cas9系統的高通量突變allele篩選。因此，如何提高編輯效率是大家關注的問題。另一個非常關鍵的問題是如何降低脫靶或不脫靶，這也是實際應用的限制因素。
　　中國科學院遺傳與發育生物學研究所韓方普實驗室前期選擇了若干玉米減數分裂特異基因的啟動子用於驅動Cas9基因的表達，希望在配子中實現高效的基因組編輯，從而在T1代獲得大量純合或雙等位的突變體。其中用到的一個為玉米DMC1基因啟動子，構建了DPC（DMC1 promoter-controlled）CRISPR-Cas9載體系統，用該載體系統轉化玉米幼胚後，結果意外發現：凡是抗性愈傷組織靶位點均發生基因組編輯，另一個非常有趣的結果是：T0代植株中出現60-70%左右的純合或雙等位的突變體，其餘為雜合或嵌合的突變體植株。並且這些純合或雙等位突變體植株(再生自一個抗性愈傷組織)含有不同的突變allele類型。通過對多個基因靶點（包括一個標記基因zb7，突變能產生白化的表型）的編輯實驗，驗證了該載體系統的高效性（下圖為對玉米zb7基因靶點的編輯）。這一技術為韓方普研究組研究細胞分裂突變體的基因功能提供了非常快速高效的方法，當代純合或嵌合突變體就可以直接觀察細胞學及染色體行為與功能。此外，也證實了產生的突變能夠穩定遺傳到T1代，並且新的突變allele類型在T1代也被發現。通過全基因組測序分析，在預測的1000多個潛在脫靶位點沒有發現脫靶突變。由於DMC1基因在進化中非常保守，該基因的啟動子也可能有潛力在別的植物中發揮類似的作用，雖然科學家在小麥中的初步嘗試結果不甚理想。
　　該研究成果於3月23日在線發表於Plant Biotechnology Journal 雜誌上（DOI:10.1111/pbi.12920）。韓方普研究組博士生馮超為該論文的第一作者，該研究得到轉基因重大專項及科技部育種專項的資助。
 
　　圖：利用DPC CRISPR/Cas9系統編輯玉米zb7基因。A. zb7基因結構、靶位點和DPC CRISPR/Cas9 載體模式圖； B. 編輯zb7基因獲得的T0代植株表型； C. 部分T0代突變植株基因型鑑定的結果。

列印 責任編輯：葉瑞優

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