電泳法

內容全文　　F. 電泳法
　　電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等）中，於電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。
　　各電泳法，除另有規定外，照下述方法操作。
　　一、紙電泳法
　　1.儀器裝置
　　包括電泳室及直流電源兩部分。
　　常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B；兩側的電泳槽均用有機玻璃（或相應材料）板C分成兩部分；外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D；裡格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出；兩側電泳槽A內的鉑電極D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。
　　電源為具有穩壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。
　　2. 操作法
　　(1) 電泳緩衝液
　　枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)
　　取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。
　　(2) 濾紙
　　取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低於4,置60℃烘箱烘乾，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙，或根據電泳室的大小裁剪，並在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用。　
　　(3) 點樣 有溼點法和幹點法。溼點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)中，溼潤後，取出，用濾紙吸乾多餘的緩衝液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩衝液中，然後用微量注射器精密點加供試品溶液，每點10μl,共3點，並留2個空白位置。
　　幹點法是將供試品溶液點於濾紙上，吹乾、再點，反覆數次，直至點完規定量的供試品溶液，然後用噴霧器將濾紙噴溼，點樣處最後噴溼，本法適用於稀的供試品溶液。
　　(4) 電泳
　　於電泳槽中加入適量電泳緩衝液,浸沒鉑電極，接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出,立即吹乾,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。
　　(5) 含量測定
　　剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏鬥濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項下的規定測定吸收度，並按吸收係數計算含量。
　　二、醋酸纖維素薄膜電泳法
　　1.儀器裝置
　　電泳室及直流電源同紙電泳。
　　2.試劑
　　(1) 巴比妥緩衝液(pH8.6)取巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，加水溶解使成1000ml。
　　(2) 氨基黑染色液
　　取0.5g的氨基黑10B,溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。
　　(3) 漂洗液
　　取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。
　　(4) 透明液
　　取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。
　　3.操作法
　　(1) 醋酸纖維素薄膜
　　取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾於濾紙中，輕輕吸去多餘的緩衝液後,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中。
　　(2) 點樣與電泳
　　於膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5％的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4～5cm為宜。
　　(3) 染色
　　電泳完畢，將膜條取下浸於氨基黑染色液中，2～3分鐘後，用漂洗液浸洗數次，直至脫去底色為止。
　　(4) 透明
　　將洗淨並完全乾後的膜條浸於透明液中10～15分鐘，取出平鋪於潔淨的玻板上，幹後即成透明薄膜，可於分光光度計上測定和作標本長期保存。
　　(5) 含量測定
　　未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定，一般採用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對百分含量。
　　洗脫法
　　將洗淨的膜條用濾紙吸乾，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶，分別浸於1.6％的氫氧化鈉溶液中，振搖數次，至洗脫完全， 於一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位，同法操作作對照。先計算吸收值總和，再計算各蛋白組分所佔百分率。
　　掃描法
　　將乾燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖，橫坐標為膜條的長度，縱坐標為吸收度，計算各蛋白組分的百分含量。亦可用微機處理積分計算。
　　三、瓊脂糖凝膠電泳法
　　1.儀器裝置
　　電泳室及直流電源同紙電泳。
　　2.試劑
　　(1) 醋酸－鋰鹽緩衝液(pH3.0)
　　取冰醋酸50ml，加水800ml混合後，用氫氧化鋰調節pH至3.0，再加水至1000ml。
　　(2) 甲苯胺藍溶液
　　取甲苯胺藍0.1g，加水100ml使溶解。
　　3.操作法
　　(1)制膠
　　取瓊脂糖約0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸－鋰鹽緩衝液(pH3.0)10ml，混勻，趁熱將膠液塗布於大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結成無氣泡的均勻薄層，即得。
　　(2) 標準品溶液及供試品溶液的製備
　　照各藥品項下規定配製。
　　(3) 點樣與電泳
　　在電泳槽內加入醋酸－鋰鹽緩衝液(pH3.0),將凝膠板置於電泳槽架上，經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板負極端分別點樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm，電流強度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘，關閉電源。
　　(4) 染色與脫色
　　取下凝膠板，用甲苯胺藍溶液染色，用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。
　　四、聚丙烯醯胺凝膠電泳法
　　1.儀器裝置
　　通常由穩流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經隔離電線接於電泳儀穩流擋上。
　　2.試劑
　　(1)溶液A
　　取三羥甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解並稀釋至100ml,置棕色瓶內，在冰箱中保存。
　　(2)溶液B
　　取丙烯醯胺30.0g、次甲基雙丙烯醯胺0.74g，加水溶解並稀釋至100ml,濾過，置棕色瓶內，在冰箱中保存。
　　(3)電極緩衝液(pH8.3)
　　取三羥甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解並稀釋至1000ml，置冰箱中保存，用前稀釋10倍。
　　(4)溴酚藍指示液
　　取溴酚藍0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90％乙醇5ml,微熱使溶解，加20％乙醇製成250ml。
　　(5)染色液
　　取0.25％(W/V)考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
　　(6)稀染色液
　　取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
　　(7)脫色液
　　7％醋酸溶液。
　　3.操作法
　　(1)制膠
　　取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡， 加0.56％過硫酸銨溶液2ml，混勻製成膠液，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達6～7cm, 然後徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鐘，待出現明顯界面時即聚合完畢，吸去水層。
　　(2)標準品溶液及供試品溶液的製備
　　照各藥品項下的規定。
　　(3)電泳
　　將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內，每管加供試品或標準品溶液50～100μl，為防止擴散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍指示液1滴,也可直接在上槽緩衝液中加0.04％溴酚藍指示液數滴，玻璃管的上部用電極緩衝液充滿，上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA，數分鐘後，加大電流使每管為2～3mA，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關閉電源。
　　(4)染色和脫色
　　電泳完畢，用裝有長針頭並吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內滑出，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鐘，以水漂洗乾淨，再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。
　　(5)結果判斷
　　將膠條置燈下觀察，根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。
　　相對遷移率 供試品和標準品的電泳區帶有時可用相對遷移率(R''<[m]>)進行比較。其計算式如下：
　　　　　　　　　　　　　進膠端到供試品或標準品區帶的距離
　　相對遷移率(R''<[m]>)＝─────────────────
　　　　　　　　　　　　　　進膠端到溴酚藍區帶的距離
　　掃描
　　將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分，由各組分的峰面積計算百分含量。
　　五、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法
　　SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定蛋白分子量,是根據大多數蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成複合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的負電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白分子相對遷移率(R''<[m]>)的大小完全取決於分子量的高低，因此可從已知分子量的標準蛋白的對數和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量。
　　1.儀器裝置
　　除另有規定外，同聚丙烯醯胺凝膠電泳。
　　2.試劑
　　(1)丙烯醯胺液溶
　　稱取丙烯醯胺22.2g與雙丙烯醯胺0.6g， 溶於100ml水中，貯於褐色瓶中低溫保存。
　　(2) 凝膠緩衝液
　　稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、磷酸氫二鈉(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g，加水至1000ml(若有沉澱析出,可加溫至37℃溶解)。
　　(3)電泳緩衝液
　　將凝膠緩衝液稀釋1倍。
　　(4)染色液
　　稱取25mg考馬斯亮藍R<[250]>,溶於57％乙醇與9.2％醋酸混合液100ml中。
　　(5)脫色液
　　取無水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀釋至1000ml。
　　3.操作法
　　除下列規定外，其他均同聚丙烯醯胺凝膠電泳。
　　(1)制膠
　　用丙烯醯胺溶液－凝膠緩衝液－水－1.6％過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺(需冷卻)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配製而成。
　　(2)標準蛋白溶液及供試品溶液的製備
　　取標準蛋白，加水製成每1ml中含2～5mg的溶液，與水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉0.04g，溶於40ml水中)1∶3混合，置冰箱中過夜。供試品照上述方法配製。
　　(3)電泳
　　調節電流使每管為8mA。
　　4.相對遷移率和分子量計算
　　將電泳脫色後的區帶用卡尺或用掃描定位法測量染料移動的距離、染色前膠條長度、蛋白移動距離和脫色後的膠條長度。按下式計算相對遷移率：

　　　　　　　　　　　　　蛋白移動的距離　　　　染色前的膠條長度　　相對遷移率(R''<[m]>)＝──────────×──────────　　　　　　　　　　　　　脫色後的膠條長度　　　染料移動的前沿距離

　　以R''<[m]>為橫坐標,已知分子量標準蛋白的對數為縱坐標,在半對數坐標紙上繪圖,由標準曲線中查出供試品分子量。