...編碼Riboswitch RNA可通過同時感應SAM和tRNA配體精確調控基因...

2020-11-30 復旦大學

核糖開關（Riboswitches）是一類非編碼RNA元件，主要存在於細菌mRNA的5′非編碼區（5′UTR），通常由適配體（aptamer）和表達平臺（expression platform）兩個功能域組成。當特定分子（ligand，配體）結合適配體域時，會引起表達平臺域的局部構象發生變化，從而打開或關閉下遊基因的表達。核糖開關廣泛存在於細菌中，它們在細菌的硫代謝、輔酶合成、胺基酸合成等基礎代謝中發揮著非常重要的調控作用，迄今為止，已有20餘類感應不同分子的核糖開關在細菌中被確認。

十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv. campestris，Xcc）屬於黃單胞桿菌屬革蘭氏陰性細菌，是引起十字花科植物（包括重要的蔬菜如白菜、蘿蔔、甘藍，重要的油料作物油菜，以及模式植物擬南芥等）黑腐病的病原菌，也是研究微生物與寄主相互作用分子機理的主要模式菌之一。此前的研究發現，在Xcc的合成甲硫氨酸必須的操縱子（met操縱子）mRNA的5′UTR區，存在一段與SAM-I型核糖開關適配體區相似的序列（核糖開關多以其識別的配體分子命名，按照RNA二級結構特徵又可分為多個亞型），預示在Xcc中Met的合成可能由SAM-I核糖開關控制。但是該潛在的SAM-IXcc核糖開關缺乏已知的核糖開關表達平臺的明顯特徵，其可能的調控功能及機制均不清楚。

近日，復旦大學生物醫學研究院教授顧宏周研究團隊聯合廣西大學生命科學與技術學院教授唐紀良團隊，研究發現SAM-IXcc RNA在黃單胞菌屬中是高度保守的，並且是一類獨特的具有雙重識別功能的核糖開關：既可以通過適配體區域結合SAM後關閉Met的合成，也可以通過表達平臺區域與空載的Met-tRNA互作從而打開Met的合成，且雙重感應可以同時發生。換言之，SAM和空載的Met-tRNA同時作用於SAM-IXcc 協調著Met的合成。小分子（SAM）和tRNA同時作用於一個核糖開關協同控制著基因表達是一個全新的發現。6月3日，相關成果以《SAM-I型核糖開關雙重感應非荷載的起始tRNA》（「SAM-I riboswitch with the ability to sense and respond to uncharged initiator tRNA」）為題，在線發表於《自然-通訊》（Nature Communications）。

研究者首先通過融合了SAM-IXcc RNA的reporter體系證實該核糖開關能特異地感應SAM並在翻譯水平上起調控作用，並進一步利用具有單鹼基解析度的in-line probing探測手段，重構了SAM-IXcc RNA的二級/三級結構，發現其與已知的SAM-I核糖開關的結構具有高度相似性；同時，in-line probing實驗結果再次確認SAM-IXcc RNA可以很好的結合SAM並區分其類似物SAH或Met（圖1）。

圖1. 確認Xcc中的I型SAM核糖開關

研究者很快發現SAM-IXcc 核糖開關結合SAM後可以很好的關閉下遊基因表達，反映在核糖體結合位點Shine-Dalgarno（SD）序列以及翻譯起始密碼子AUG均被屏蔽在穩定的RNA Stem裡。然而，在不結合SAM時，整個開關處於「半打開」狀態：起始密碼子AUG暴露了出來，但是SD序列依然被屏蔽（圖2）。這種不徹底的打開較為異常，有別於已知的核糖開關工作原理。這促使研究者思考是否有其它因素共同參與SAM-IXcc 核糖開關的調控。

圖2. SAM-IXcc 感應SAM並在翻譯水平上的調控

在細菌中，已知有兩類核糖開關分別調控著Met的合成，SAM核糖開關是其中一類（又稱為S Box），另一類為T Box。通常S Box感應到高濃度的SAM後會關閉Met的合成，而T Box感應到積聚的空載Met-tRNA後會打開Met的合成。在Xcc中，SAM-IXcc下遊的第一個基因Homoserine O-acetyltransferase（encoded by XC1251，圖1a）緊密參與著Met的合成代謝並延伸至負載Met-tRNA的合成（圖3）。因此，研究者猜測空載的Met-tRNA可能就是參與SAM-IXcc 核糖開關SD區打開或屏蔽的其它因素，儘管SAM-IXcc不具備已知T Box的特徵序列。

圖3. Xcc中Met和SAM的合成及代謝途徑

凝膠阻滯實驗（EMSA）很快證明了該猜測：SAM-IXcc的表達平臺能夠與空載的起始Met-tRNA（tRNAfMet）結合，並且這種結合非常特異，Xcc中的其它所有tRNA以及負載了Met的tRNAfMet都不具備這種結合能力；進一步研究發現在SAM-IXcc核糖開關上的結合位點就是屏蔽SD的抗SD序列（anti-SD），當空載的tRNAfMet結合了SAM-IXcc後，SD序列才得到徹底的釋放。但是空載的tRNAfMet通過哪些鹼基如何與SAM-IXcc形成特異互作的，目前尚不清晰，有待進一步的研究。

最後，研究者提出了SAM-IXcc的調控模型（圖4）：當Xcc中的空載tRNAfMet濃度低時，意味著Met濃度高（tRNA都處於裝載狀態），若此時SAM濃度也高，則SAM結合到SAM-IXcc上完全關閉Met/SAM的合成（OFF），節約原料併合理控制SAM和Met水平；但如果此時SAM濃度低，那麼SAM-IXcc則不結合SAM從而半打開Met的合成通路（Partial ON 1），因為Met的濃度已經是足夠高的，無須迫切提升Met，當一部分Met被合成轉化為SAM後，SAM的濃度自然得到補足而Met的濃度也可以維持在一個合理的水平。類似的，當Xcc中的空載tRNAfMet濃度高時，意味著Met濃度低，若此時SAM濃度也低，則空載的tRNAfMet結合到未結合SAM的SAM-IXcc上，完全釋放出SD和AUG序列，核糖開關完全打開Met/SAM的合成（Full On），從而可儘快恢復SAM和Met的水平；但如果此時SAM濃度高，那麼SAM-IXcc則同時結合SAM以及空載的tRNAfMet，釋放出SD序列但仍屏蔽AUG，從而半打開Met的合成通路（Partial ON 2），一定程度上補足Met的水平即可。

圖4. SAM-IXcc的假想工作模型

綜上所述，該研究在革蘭氏陰性菌中發現了一種新型的SAM-I型核糖開關，它的表達平臺區又隱藏著一個感應tRNA的開關。這樣的雙重開關被認為可以更和諧更合理地調控Met的合成代謝通路，使得相應的細菌在進化的過程中更具備生存優勢。這項研究豐富了人們對核糖開關調控機制的認識，也為更好地幹預細菌的代謝提供了新的思路。

據悉，廣西大學生命科學與技術學院教授唐紀良和復旦大學生物醫學研究院教授顧宏周為本文的共同通訊作者。廣西大學唐東階，復旦大學附屬浦東醫院杜鑫雨，復旦大學附屬中山醫院時強，廣西大學、遵義醫科大學張建玲為本文共同第一作者。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41467-020-16417-z

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