「CRISPR/Cas9基因編輯技術」的簡介及其應用

2021-01-21 學甫無境


1.名稱來源和組成


CRISPR簇是一個廣泛存在於細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重複序列家族，充當了防禦外源遺傳物質的「基因武器」。

CRISPR位點結構圖

CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規律間隔的短回文重複序列（上圖展示了完整的CRISPR位點的結構）。


其中，CRISPR序列由眾多短而保守的重複序列區和間隔區組成。重複序列區含有迴文序列，可以形成發卡結構。而間隔區比較特殊，它們是被細菌俘獲的外源DNA序列。


這就相當於細菌免疫系統的「黑名單」，當這些外源遺傳物質再次入侵時，CRISPR/Cas系統就會予以精確打擊。而在上遊的前導區被認為是CRISPR序列的啟動子。


另外，在上遊還有一個多態性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區域共同發生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關聯基因（CRISPR associated，Cas）。目前已經發現了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因。


Cas基因與CRISPR序列共同進化，形成了在細菌中高度保守的CRISPR/Cas系統。


2.CRISPR/Cas9技術應用


CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。CRISPR/Cas9技術完全刪除某個基因表達，而RNA幹擾技術只能將該基因表達降低到非常低的水平，兩種技術雖然操控了同一種基因，但細胞完全有可能出現不同的反應。


在嚮導RNA和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。

CRISPR/Cas技術及其應用


（1）基礎應用之一－基因敲除


如果在基因的上下遊各設計一條嚮導RNA（嚮導RNA1，嚮導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，嚮導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下遊的DNA雙鏈斷裂。


而生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。


（2）基礎應用之二－替換或者突變


如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒（供體DNA分子），這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。這樣就可以實現基因的替換或者突變.


（3）其他應用


對受精卵細胞進行基因編輯，並將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。


隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術已經被廣泛的應用。除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，它還可以被用於基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。

CRISPR/Cas9 基因編輯技術示意圖


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