利用金屬多酚配位技術構建符合下肢缺血治療性血管生成的功能性微囊載體，通過表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）抗炎、抗氧的特性來改善缺血微環境，同時實現Zinc離子的緩釋減毒及促血管生成作用，為下肢缺血性疾病的治療提供新的思路和策略。
嚴重的下肢缺血性疾病，手術或介入血管重建術是最有效的治療方法，但存在手術併發症及術後血管再狹窄的問題，且該類患者往往合併有心腦血管疾病，從而喪失血管重建的機會。因此，採用基因或幹細胞實現治療性血管生成的理念在過去20年受到人們的重視，但臨床效果並不顯著，主要原因是忽略了缺血微環境的問題。本研究從改善下肢缺血微環境入手，採用生物材料技術在實現下肢缺血微環境改善的同時又進一步發揮材料的促進血管生成作用，達到「優化土壤+改良種子」的理念，從而實現下肢缺血性疾病治療性血管生成的效果。在此思路的引導下，我們沿用了既往金屬-多酚配位的技術，選擇具有抗炎、抗氧、改善缺血微環境作用的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），同時選擇能夠與EGCG配位且具有誘導血管生成作用的Zinc離子，通過EGCG與Zinc離子的配位作用製備微囊載體，不僅實現EGCG改善缺血微環境，同時實現Zinc離子的緩釋減毒及促進血管生成作用，為下肢缺血性疾病的治療提供新的思路和策略（Fig.1）。
Fig. 1. Schematic diagram of EGCG-Zinc capsule with therapeutic angiogenesis function on mouse limb ischaemia.
本研究以CaCO3為模板在其表面進行多酚（EGCG）與金屬（Zinc離子）配位形成保護層，然後用EDTA去除CaCO3形成EGCG-Zn配位的微囊載體。通過傅立葉紅外光譜、X-射線光電子能譜、動態光散射儀以及掃描電鏡等檢查提示EGCG-Zn配位後發生了相應的化學鍵、結合能、電位以及形態的變化，證實了該微囊的成功製備，並實現約48小時的Zinc離子緩釋效果（Fig.2）。此外，研究也通過CCK-8細胞毒實驗證實了Zinc離子的緩釋過程能有效降低其毒性作用以及 EGCG-Zn材料良好的生物相容性。
Fig. 2. The synthesis and characterization of EGCG/Zn Ps. (A) FTIR spectrometry of EGCG and EGCG/Zn Ps. The high-resolution O 1s XPS spectra of EGCG (B) and EGCG/Zn (C). SEM image of EGCG/Zn@CaCO3 (D) and EGCG/Zn Ps (E, F). (G) The zeta potentials of CaCO3, EGCG/Zn@CaCO3 and EGCG/Zn Ps. (H) In vitro release of Zn2+ from EGCG/Zn Ps incubating in H2O (pH 7.4) or H2O2 (40 μM). Values are mean ± SD (n = 3)
通過體外細胞實驗分別證實了材料的ROS清除、抑炎、抗氧、促進VEGF表達及促進細胞遷移的生物學功能。採用LPS刺激RAW.264.7細胞產生炎症因子，而材料預處理後的RAW.264.7細胞，炎症因子（TNF-α，IL-6）表達量明顯降低。在細胞毒性濃度的ROS水平下，材料共孵育組可有效的清除過量ROS以減少細胞死亡。此外，在25-50uM濃度時，材料刺激VEGF表達最為明顯（Fig.3）。此外，分別採用了H2O2和氧自由基試劑證實了材料的ROS清除作用，且通過DCFH-DA(2',7'-二氯螢光黃雙乙酸鹽) ROS分子探針的方法，分別採用共聚焦定性觀察，以及流式細胞技術定量分析證實材料的細胞內ROS清除能力。研究表明，材料的ROS清除能力具有濃度依賴性。
Fig. 3. Effect of EGCG/Zn Ps on different cells. The levels of IL-6 (A) and TNF-α (B) in the supernatant of RAW264.7 cells. (C) The NIH 3T3 cells survival detected by MTT assay. (D) The VEGF expression on HUVEC in response to EGCG/Zn Ps. The data are presented as the mean ± SD (n = 3, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
最後通過小鼠後肢缺血模型進一步驗證了該微囊載體體內促血管生成的效果（Fig. 4）。通過大體照、缺血評分、體重、都卜勒血流成像、Micro-CTA微小血管評估、以及組織學檢測指標顯示，微囊組小鼠肢體缺血及血流恢復較快，且新生血管密度最高，血小板內皮細胞粘附分子31（CD31）和增殖細胞核抗原（PCNA）在缺血組織中的表達為正常對照組的3-4倍。除此之外，研究還通過Western及PCR證實了材料能有效誘導VEGF的表達。結果均證明材料具有顯著的促血管生成的作用。
Fig. 4. Limb blood flow and neovascularization assessment. LDPI images (A) and quantitative (C) showed blood flow of limbs (n = 6, **P < 0.01, ***P < 0.001, ** and *** are relative to all groups). Micro-CTA images (B) and quantitative (D) showed vascular density. The data are presented as the mean ± SD (n = 3, *P < 0.05)
陳作觀：醫學博士，北京醫院血管外科住院醫師，畢業於北京協和醫學院，師從李擁軍教授，曾於美國加州大學聖地牙哥分校交流半年。承擔中央高校學生課題1項，以第一作者（含共一）發表文章15篇，其中SCI 8篇，累計影響因子約40分，最高單篇10.317分。獲得「北京市優秀畢業生、博士國家獎學金，第13屆全國血管外科學術會議一等獎」等獎勵10餘項，參加美國VEITH大會等各類會議發言20餘次。臨床工作方向為周圍血管疾病；基礎研究方向為下肢缺血性疾病的治療性血管生成。
段建偉（共同第一作者）：北京協和醫學院生物醫學工程研究所博士研究生，曾於英國卡迪夫大學交流半年。以第一作者（含共一）發表SCI文章3篇，累計影響因子約24分，主要研究方向為生物材料的藥物緩控釋應用。
李擁軍：北京醫院血管外科主任，醫學博士，主任醫師，北京協和醫學院、北京大學醫學部博士生導師，中國醫藥教育協會周圍血管疾病委員會主任委員。
2000年獲北京協和醫科大學外科學博士學位，師從管珩教授。2002年至2006年期間，分別於德國法蘭克福醫學中心血管外科中心、美國伊利諾州立大學、美國杜克大學醫學中心心血管實驗室作為訪問學者或博後。2016.8-至今任北京醫院血管外科主任醫師，主刀手術超過300臺/年，首創提出大動脈炎、顱外頸動脈瘤的外科分型，並挑戰弓上多支動脈同期重建的理念。長期從事下肢缺血的治療性血管生成的相關基礎及應用型研究，以第一作者或通訊作者發表文章80餘篇，其中SCI論文20篇。以第1獲獎人或主要參與人獲得華夏醫學科技獎三等獎等省部級獎勵5項，地區及院校級獎勵15項。承擔國家自然科學基金、參與國家重點研發計劃等各類課題21項，目前在研課題12項。以副主編或參編著作7本；主筆或參與臨床疾病診治指南撰寫2份。同時兼任中國醫師協會外科醫師分會血管外科醫師委員會常委委員、中華醫學會外科學分會血管外科學組委員等各類學術任職近20餘項。在《Chinese Medical Journal》、《中華醫學雜誌》等14家刊物擔任編委或審稿人。
課題組主頁：
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楊菁：中國醫學科學院生物醫學工程研究所研究員，博士，北京協和醫學院生物醫學工程、藥劑學雙專業博士生導師，英國Cardiff大學訪問學者。天津市創新推進計劃重點領域「免疫活性生物材料」創新團隊負責人及天津市人才發展特殊支持計劃高層次 「組織修復生物活性材料」創新創業團隊負責人。北京醫院客座教授，中國生物醫學工程學會生物材料分會委員、納米醫學與工程分會委員，天津生物醫學工程學會理事、組織工程專業委員會副主任委員、國家自然科學基金評審專家、教育部、科技部入庫評審專家，兼任國際生物醫學工程雜誌編委、ACS Appl. Mater. Interfaces 等多家SCI收錄雜誌或核心期刊審稿人。從事生物醫用材料設計合成和藥物遞送系統的研究，作為課題負責人和主要參加人先後承擔國家自然基金重點及面上項目、863、國家九五攻關、國家科委、國家計生委、衛生部和天津市的重點課題及醫科院的科研項目近五十項。獲授權發明專利六項，以第一作者和通訊作者身份在Biomaterials、Nanoscale、ACS Appl. Mater. Interfaces 等雜誌發表SCI及核心期刊學術論文近八十篇，榮獲天津市自然科學二等獎。
課題組主頁：
http://pumc.teacher.360eol.com/teacherBasic/preview?teacherId=4543
該研究得到了國家自然科學基金委（81870351, 31771097, 81972899）, 國家重點研發計劃(2018YFC2000301), 中國醫學科學院醫學科學創新工程（2018-12M-1–002, 2017-12M-1–016）, 北京協和醫學院學科建設項目(201920102101), 北京市自然科學基金（7192186）, 中央高校基本科研業務費（3332018185, 3332018174）, 北京醫院博士啟動基金（BJ-2018-038）, 天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(17JCZDJC37400)、天津市政府高新技術領軍人才專項計劃和天津市創新推進計劃免疫活性生物材料重點創新團隊。
Zuoguan Chen#, Jianwei Duan#, Yongpeng Diao, YouluChen, Xiaoyu Liang, Huiyang Li, Yuqing Miao, Qing Gao, Liang Gui, Xiaoli Wang, Jing Yang*, Yongjun Li*.
ROS-Responsive Capsules Engineered from EGCG-Zinc Networks Improve Therapeutic Angiogenesis in Mouse Limb Ischemia[J].
Bioactivematerials,6(2021)1-11.
Bioactive Materials是一本高質量英文期刊，目前已經被SCIE、PubMed Central、Scopus、Embase收錄。同時本刊還入選了2019年中國科技期刊卓越行動計劃--「高起點新刊」項目。
2020年Bioactive Materials 獲得第一個影響因子8.724 ，在Materials Science，Biomaterials領域排名第二。