題目英文：Network-Based Combinatorial CRISPR-Cas9 Screens Identify Synergistic Modules in Human Cells
題目中文：基於網絡組合CRISPR-Cas9篩選識別人類細胞中的協同模塊
發表時間：2019年2月14日 雜誌：ACS Synthetic Biology 影響因子： 4.411
摘要英文：Tumorigenesis is a complex process that is driven by a combination of networks of genes and environmental factors; however, efficient approaches to identifying functional networks that are perturbed by the process of tumorigenesis are lacking. In this study, we provide a comprehensive network-based strategy for the systematic discovery of functional synergistic modules that are causal determinants of inflammation-induced tumorigenesis. Our approach prioritizes candidate genes selected by integrating clinical-based and network-based genome-wide gene prediction methods and identifies functional synergistic modules based on combinatorial CRISPR-Cas9 screening. On the basis of candidate genes inferred de novo from experimental and computational methods to be involved in inflammation and cancer, we used an existing TGFβ1-induced cellular transformation model in colonic epithelial cells and a new combinatorial CRISPR-Cas9 screening strategy to construct an inflammation-induced differential genetic interaction network. The inflammation-induced differential genetic interaction network that we generated yielded functional insights into the genes and functional module combinations, and showed varied responses to the inflammation agents as well as active traditional Chinese medicine compounds. We identified opposing differential genetic interactions of inflammation-induced tumorigenesis: synergistic promotion and suppression. The synergistic promotion state was primarily caused by deletions in the immune and metabolism modules; the synergistic suppression state was primarily induced by deletions in the proliferation and immune modules or in the proliferation and metabolism modules. These results provide insight into possible early combinational targets and biomarkers for inflammation-induced tumorigenesis and highlight the synergistic effects that occur among immune, proliferation, and metabolism modules. In conclusion, this approach deepens the understanding of the underlying mechanisms that cause inflammation to potentially increase the cancer risk of colonic epithelial cells and accelerate the translation into novel functional modules or synergistic module combinations that modulate complex disease phenotypes.
摘要中文：腫瘤發生是一個複雜的過程，由基因和環境因素的網絡共同驅動；然而，缺乏有效的方法來識別受腫瘤發生過程幹擾的功能網絡。在這項研究中，我們為炎症誘導腫瘤發生中起決定因素的功能性協同模塊的系統性發現提供了一種基於網絡的綜合策略。我們的方法通過整合基於臨床和基於網絡的全基因組基因預測方法，優先選擇候選基因，並組合CRISPR-Cas9篩選策略識別功能協同模塊。根據從實驗和計算方法得出的與炎症和癌症有關的新候選基因，我們在結腸上皮細胞中使用了現有的TGFβ1誘導的細胞轉化模型和一種新的CRISPR-Cas9組合篩選策略來構建炎症誘導的差異遺傳相互作用網絡。我們所建立的炎症誘導的差異遺傳相互作用網絡對基因和功能模塊組合產生了功能性見解，並對炎症因子和活性中藥化合物表現出不同的反應。我們確定了炎症誘導腫瘤發生的相反差異遺傳相互作用：協同促進和抑制。協同促進狀態主要由免疫和代謝模塊中的缺失引起；協同抑制狀態主要由增殖和免疫模塊或增殖代謝模塊中的缺失引起。這些結果提供了對炎症誘導腫瘤發生可能的早期聯合靶點和生物標誌物的認識，並強調了免疫、增殖和代謝模塊之間的協同效應。總之，這種方法加深了對一些潛在機制的理解，包括炎症潛在增加結腸上皮細胞癌變風險的潛在機制，以及向調節複雜疾病表型的新功能模塊或協同模塊組合的加速轉化的認識。
背景中文：
炎症誘導的腫瘤發生（IIT）是由複雜基因網絡的某些擾動引起。全面了解將炎症與腫瘤發生聯繫起來的功能網絡對於總體上預防和治療炎症誘導的腫瘤發生至關重要，尤其對於早期診斷至關重，然而缺乏有效的方法來識別受到炎症誘導的腫瘤發生幹擾的功能網絡。
目前，隨著大量基因表達數據的積累，已經使用不同的計算方法來推斷基因網絡。如基於網絡拓撲中的方法或通過整合網絡拓撲和功能數據而生成的方法，最近已經被引入以探索各種生物網絡中的功能模塊。本文提出了一種綜合的計算和實驗方法來系統地發現炎症誘導腫瘤發生的功能協同模塊。
腫瘤發生中的兩個關鍵事件是基因組不穩定性的累積和細胞惡性轉化。TGFβ1是腸黏膜慢性炎症的重要信號，其過度表達可能導致上皮細胞過度增殖，並增加結腸炎引起的結腸癌的風險。目前已經存在基於轉化生長因子-β1（TGFβ1）誘導的結腸上皮細胞惡性轉化細胞模型。為了模擬炎症促進結腸上皮細胞惡性轉化的細胞轉化，本文使用了結腸炎誘導結腸癌的細胞模型，即在TGFβ1的刺激下培養人腸上皮細胞系NCM460。
方法中文：（重點描述清楚數據及數據來源）
1）將臨床基因表達數據與全基因組基因預測方法相結合，以鑑定與炎症和癌症相關的候選基因（如下圖A）。
Ø利用 CIPHER 方法，對疾病候選基因進行排序，分別預測炎症性腸病（IBD；OMIM ID 266600）和結直腸癌（CRC；OMIM ID 114500）的前100個候選基因。進一步選擇了59個候選基因，包括一部分CIPHER相關基因和12個人工總結的KEGG通路中的一部分基因（這些通路與炎症和癌症有關，具體如下）
Ø選擇了手工總結炎症與癌症之間聯繫的30個候選基因。
Ø在GSE4183數據集中，顯示IBD與正常組織之間以及CRC與正常組織之間的基因表達存在顯著差異，這個過程選擇了38個與炎症和癌症相關的顯著差異表達基因。
Ø最後，這幾個集合中去重後共存在84個候選基因，這些基因在炎症和癌症之間起著至關重要的作用。
2）使用了一個現有的腸道惡性轉化細胞模型（TGFβ1的刺激下培養NCM460細胞系）結合基於CRISPR的雙敲除技術確定炎症誘導腫瘤發生的協同功能模塊，並構建一個差異遺傳相互作用網絡（如下圖B）。
Ø利用sgRNA慢病毒文庫感染能穩定表達cas9蛋白的NCM460細胞株，並將獲得的細胞群分為實驗組和對照組。
Ø實驗組用TGFβ1培養，對照組無TGFβ1培養。細胞培養10天後，收集兩組細胞的細胞群，計算生長率（Growth rates，測量10天後活細胞數量來確定）以及提取其基因組DNA進行深度測序。這裡用「ρ」來表示TGFβ1誘導的細胞生長速率，通過量化實驗組和對照組細胞生長速率的差異來計算。具體公式如下
初始時間為t0，NTX(t)表示sgRNA X誘導基因突變以及TGFβ1培養下在t時的細胞數量；NTWT(t)表示無sgRNA 誘導基因突變（即野生型）但在TGFβ1培養下t時的細胞數量；NUX(t)表示sgRNA X誘導基因突變但無TGFβ1培養下在t時的細胞數量；NUWT(t)表示無sgRNA 誘導基因突變（即野生型）同時也無TGFβ1培養下t時的細胞數量；KWT表示TGFβ1培養下所提升的細胞生長率，ρX表示TGFβ1誘導下sgRNA X的細胞生長速率。
Ø使用單突變以及雙突變的表型（即ρ，生長率），計算雙突變的dGI得分（differential genetic interaction score）。最終得到差異遺傳相互作用網絡。註：兩個單獨sgRNA表型之間的線性關係可以可靠地預測給定的雙sgRNA的典型表型，因而GI量化為雙突變表型實際與預期表型的偏差。
Ø在構建的顯著差異遺傳互作網絡（significantly different genetic interaction network）中識別出協同模塊。
3）基於協同模塊進行藥物預測
Ø從中藥化合物資料庫HerbBioMap中，檢索了六味地黃（LWDH）類似處方中包含的化合物，並使用drugCIPHER算法預測了相應化合物的靶標。
Ø對於特定的化合物，可以獲得炎症誘導腫瘤發生的遺傳相互作用的化合物得分並進行排序。得分計算如下：
其中dGI (i,j)是基因i和j的dGI得分，ρ(j)是基因j的表型值，S(i,k)是化合物k的drugCIPHER得分。
結果中文：
1、基因共表達網絡的構建
在確定炎症到腫瘤發生的候選致病基因時，本文進行了差異分析。基於DEGs進行基因共表達分析對候選疾病基因進行排序。最終通過CIPHER 方法、人工總結以及差異分析等確定了84個候選基因。利用這84個基因在結腸（38個）、胃（58個）和肝臟（314個）基因表達數據中構建了全局的基因共表達網絡，並在結腸基因共表達網絡中定義了2個顯著富集的模塊：免疫系統過程和代謝過程。
2、基於CRISPR的雙敲除識別差異遺傳互作網絡
為了證實84個候選基因在炎症誘導腫瘤發生中的作用，我們用雙sgRNAs敲除NCM460細胞中所有可能的相互作用，並構建了這些基因的差異遺傳相互作用圖（dGImap），以揭示其功能關係。
如方法所示，得到單突變以及雙突變的表型（即生長率）後，可以計算雙突變的dGI得分。最終，構建了差異遺傳相互作用網絡，其包含7056個基因對的定量dGI得分。
所有雙突變的dGI得分近似正態分布，因此取dGI <−0.84或dgi> 1.11的雙突變，最終獲得84對基因對，其中39個陽性基因對和45個陰性基因對。
下圖A表示測序下每個gRNA的read數；圖B表示實驗和對照組亞群之間的表型差異；圖C表示陽性和陰性表型的差異數量，其中許多相互作用的樞紐被認為是免疫或代謝途徑中的關鍵基因；圖D表示dGI分數遵循正態分布，平均值為0.13，標準偏差為0.49。
3、不同的相互作用模式表明特定的炎症誘導腫瘤發生機制
上述獲得的84對基因對包含63個基因，在GO富集中，主要富集到免疫、代謝以及細胞增殖等過程。而通過這84對基因對所構建的顯著差異遺傳互作網絡（significantly different genetic interaction network），本文識別出三種模塊組合可強烈影響炎症誘導的腫瘤發生（如下圖）。增殖和免疫模塊或增殖和代謝模塊的共存協同抑制炎症誘導的腫瘤發生過程，而代謝和免疫模塊的共存協同促進炎症誘導的腫瘤發生過程。
為了評估在本研究中由sgRNA確定的差異遺傳相互作用的質量，我們使用RNA幹擾（shRNA）來確認獲得的表型。發現同時靶向三個特定基因對的sgRNA對和shRNA對表現出相似的協同作用或拮抗作用（如下圖所示）。
4、基於協同模塊進行藥物預測
從中藥化合物資料庫HerbBioMap中，檢索了六味地黃（LWDH）類似處方中包含的化合物，並使用drugCIPHER算法預測了相應化合物的靶標。對於特定的化合物，可以獲得炎症誘導腫瘤發生的遺傳相互作用的化合物得分並進行排序。使用細胞系實驗獲得四種化合物的半數抑制濃度（IC50）值（如下圖），並以此進行化合物的排序。這四種化合物的實驗排名與預測排名略有不同，但計算分析可用於識別有效抑制腫瘤細胞生長的中藥化合物（如下圖）。
討論中文:
本文提出了一種基於網絡和CRISPR的綜合方法，用於系統發現炎症誘導腫瘤發生的功能協同模塊。發現三種模塊組合可強烈影響炎症誘導的腫瘤發生（增殖、免疫以及代謝模塊）。同時在炎症誘導的基因相互作用網絡的基礎上預測化學成分的作用比以前描述的組合疾病基因和藥物篩選平臺更具優勢，因為它使用高通量篩選來減少人工，材料和時間的成本。
總之，本研究為有關炎症如何誘導惡性腫瘤發生並加速轉化為新型協同功能模塊的潛在機制提供了新見解。