引言
配體與其分子靶標結合機制的精準描述是開展藥物設計的基礎。配體-蛋白質結複合物的結合自由能計算對於研究配體的結合模式至關重要。而精確的結合自由能計算方法往往因其較差的用戶友好性而受到了一定限制進而妨礙了它們的廣泛應用。瑞士提契諾大學的Vittorio Limongelli詳細介紹了漏鬥-元分子動力學方法的高級應用指南（Funnel-Metadynamics Advanced Protocol, FMAP），作者開發了一個靈活且易於使用的基於用戶圖形界面（GUI）的用於漏鬥-元分子動力學模擬的軟體工具，漏鬥-元分子動力學方法採用了漏鬥形約束勢能來研究配體-蛋白質結合模式，並能夠準確計算出配體與蛋白質的絕對結合自由能。本FMAP指導使用者完成結合自由能計算過程的所有階段，從準備輸入文件到成品模擬再到最後的結果分析。此外使用該方法除了能夠提供配體結合模式和絕對的結合自由能之外,還能給出其它潛在的配體結合模式和水分子的作用,進而提供對配體結合機理的詳細描述。
在介紹FMAP之前，我們先簡單描述下結合位點以及結合模式和結合機制的定義:
1）結合位點(binding site)是靶標分子與內源性或外源性配體結合的區域;
2）配體結合模式(ligand binding mode)是配體在結合位點的結合構象的表示;
3）結合機理(binding mechanism)是配體進入結合位點的途徑。
早在2013年，文章作者就提出了漏鬥-元分子動力學（FM），這是一種使用自適應地偏置勢來模擬配體從其完全溶劑化狀態到最終結合位點的結合過程的結合自由能計算方法。在選定的自由度空間內的高斯函數之和稱為集合變量（CV）。這種方法可以研究配體結合模式，並提供精確的蛋白質-配體結合自由能計算。此外,FM還能提供對配體結合機制的動力學過程的解釋，包括存在其它潛在的配體結合模式和其他與能量相關的狀態（如結合速率限制狀態）。FM將元動力學的偏置勢與應用於靶標結構的漏鬥形約束勢相結合,約束勢是包括配體結合位點的錐形約束和指向溶劑的圓柱形約束的組合。在FM中，當配體探索漏鬥區域內的區域時，系統不會感覺到漏鬥勢的存在;當配體到達漏鬥的邊緣時，會向系統施加排斥勢，從而使其從漏鬥外部的區域中消失。如果適當選擇漏鬥的形狀，則結合位點處的採樣不會受到外部偏置勢的影響，而在外部水環境中，排斥勢會減小探索圓柱區域的空間。如此帶來的結果是，通過觀察多個結合和未結合事件進而實現加速採樣，這些事件導致自由能計算和定量良好表徵的結合自由能面（BFES）的快速收斂。通過BFES，可以將配體結合模式確定為最低自由能最小值，並使用以下公式計算絕對的蛋白質-配體結合自由能：
在此，C0是所有反應分子的1 M的標準濃度，可用於與實驗進行比較；kB是玻爾茲曼常數；T是系統的溫度；kb是結合態和未結合態之間的自由能差中獲得的平衡結合常數。結合自由能僅取決於這兩個狀態的自由能值，而與連接彼此的路徑無關。目前，FM已被不同的研究小組成功地用於研究各種配體-蛋白質和配體-DNA結合複合物，確定與晶體學數據相符的結合方式，並準確地預測了實驗性結合自由能。表1列出了FM應用於不同體系的情況。
表1 FM的應用情況總結
圖片源自Nature Protocols.
作者在程序中提供了設置漏鬥形偏置勢所需的參數的更詳細說明，成功案例研究中使用的FM參數如圖1所示。
圖1 FM參數設置示例
圖片源自Nature Protocols.
與目前可用的結合自由能計算手段相比，FM具有以下優點：
1)不需要關於配體結合模式的先驗知識。研究者可以隨機選擇相對於蛋白質結合位點的配體的起始位置，並讓配體找到其到達結合位點的途徑；
2)所研究的配體之間不需要結構相似性，例如在FEP的情況下；
3) 配體、蛋白質和溶劑分子是明確的，並且在FM中具有完全的柔性。因此，在配體結合過程中可以細緻研究和評估水分子和蛋白質的運動。這代表了相對於其他方法的重大改進，因為溶劑化和去溶劑化作用、構象選擇和誘導擬合作用通常在正確識別配體結合模式中起決定性作用；
4）整個配體結合過程是可重複的；
5）FM對非收斂結果能夠自我診斷。在CV選擇不當的情況下，計算不會收斂，並且可以輕鬆檢測到採樣問題（例如磁滯現象）。
當然，FM方法也有一定的局限或者難點所在，主要體現在：
1）CV的選擇。在FM中，CV的選擇是至關重要的一步，因為錯誤的CV選擇會導致結果無法收斂。CV必須描述配體結合過程中系統的最慢自由度，從而能夠區分模擬過程中訪問到的系統的不同狀態；
2）維度問題。FMAP十分靈活，可以適應使用任何類型的CV。但是，CV的數量應儘可能少，因為重建自由能的計算成本隨CV的數量呈指數增長；
3）自由能收斂問題。在錯誤的CV選擇或忽略重要的慢自由度的情況下，自由能計算就不會收斂；
4）準確度。FM已被證明能夠以小於1.5 kcal mol的精度預測實驗結合自由能。但是，應該考慮到FM是基於MD模擬的。因此，計算結果取決於蛋白質和配體所用力場參數的準確性以及系統的設置（例如胺基酸-配體質子化狀態）；
5）計算成本。FM模擬代碼的最新版本和計算能力的指數級增長使得如今有可能在合理的時間內在本地計算機和高性能計算集群（HPC）上執行計算。值得一提的是在原文中，作者特別針對CV的選擇和FM計算收斂檢查給了詳細的建議和步驟描述，本文由於篇幅所限，不在此一一列出。
FMAP利用GUI進行交互以準備輸入文件，以進行FM模擬和結果分析。GUI通過以下三個階段組成的分步過程來幫助研究者進行快速地上手使用：
1）預處理階段。在靶標蛋白上設置漏鬥形偏置勢；定義FM參數並準備用於FM模擬的輸入文件（通過GUI建議標準值並顯示幫助消息）；
2）模擬階段。用戶使用其首選的MD模擬軟體（包括Gromacs、Amber和NAMD）啟動FM，同時提供了命令和故障排除信息的列表；
3）後處理階段。FM結果和數據檢索工具的分析。
FMAP GUI（https://github.com/limresgrp/FMAP_v1/tree/master/funnel_gui）以VMD程序插件形式體現，模擬代碼在PLUMED-v.2（https://www.plumed.org/doc-master/user-doc/html/_installation.html）中實現。圖2和圖3展示了FMAP GUI在預處理階段和後處理階段的軟體設置界面。註：原文對軟體每個設置選項以及使用過程中可能遇到的問題都進行了詳細的描述和給出了合理的建議，具體請參看原文。
圖2 FMAP GUI預處理界面（Funnel.tcl）
圖片源自Nature Protocols.
圖3 FMAP GUI後處理界面（FFS.tcl）
圖片源自Nature Protocols.
最後，作者將FAMP應用到了苯甲醯胺-胰蛋白酶體系（圖4），通過該方案計算得出的胰蛋白酶-苯甲醯胺的絕對結合自由能為8.2±0.5 kcal/mol，與先前的實驗工作中報導的幾乎完全一致，並且苯甲醯胺結合模式的三維結構與X射線晶體學揭示的結構十分接近（圖5），顯示了FAMP方法強大的可靠性和計算準確性。
圖4 苯甲醯胺-胰蛋白酶體系的BFES
圖片源自Nature Protocols.
圖5 苯甲醯胺結合模式的FAMP計算結果（灰色）與晶體結構（橙色，PDB:4i8g）的比較
圖片源自Nature Protocols.
參考文獻
Ligand binding free-energy calculations with funnel metadynamics. Stefano Raniolo,Vittorio Limongelli. Nature Protocols. 2020:2837–2866. DOI: 10.1038/s41596-020-0342-4
Funnel metadynamics as accurate binding free-energy method. Limongelli, V. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 6358–6363 (2013): DOI: 10.1073/pnas.1303186110
相關文章
PNAS | 機器學習方法有望解決基於結構虛擬篩選中假陽性問題JMC | 資源有限的小型藥企如何利用計算方法加速藥物發現AI居然無需學習蛋白-配體相互作用就能計算蛋白-配體相互作用能力百科 | 典型配體-受體相互作用類型一覽