先睹為快
靶點
A3腺苷受體adenosine A3receptor (A3R)
小分子配體
激動劑分子NECA和IB-MECA
計算方法
同源模建（homology modeling）
分子對接（Docking）
分子模擬（MD Simulation）
自由能計算（MM-GBSA Calculations）
計算軟體
Adenosiland web-service，GOLD/ChemScore，Desmond，Schrodinger
單位與作者信息
劍橋大學的Graham Ladds教授；
雅典大學的Antonios Kolocouris教授
發表雜誌
Journal of Medicinal Chemistry
計算流程
模建A3R的蛋白結構，將激動劑對接到活性口袋中，選擇每個模型中打分top3的binding poses進行150ns的MD模擬，軌跡分析A3腺苷受體與激動劑的相互作用特徵。關鍵的胺基酸進行突變實驗驗證，並與MM-GBSA計算結果ΔGeff進行對比，揭示影響激動劑活性的重要殘基，用於後續A3R激動劑的設計指導
背景
腺苷受體(ARs)是G蛋白偶聯受體(GPCRs)的家族成員，迄今為止，已經鑑定出A1, A2A, A2B, A3四個亞型。本文研究的A3腺苷受體（A3R）被證實在各種腫瘤細胞中的高表達，可以作為抑制癌細胞增殖的藥物靶點。腺苷（Ado）是A3R的內源性激動劑，通過對Ado的核糖部分修飾和腺嘌呤環取代，發現了兩類激動劑NECA和IB-MECA（圖1）。其中，NECA分子是一類非選擇性AR激動劑，由於對各種亞型的腺苷受體都有作用；IB-MECA是目前最有效的亞型選擇A3R激動劑，已經處於炎症和癌症的臨床試驗。
圖1. 腺苷分子，激動劑NECA和IB-MECA的結構示意圖
圖片來源JMC
腺苷受體亞型中A1, A2A 和Ado/激動劑的複合物晶體已經解析出來了，而A3R由於結晶困難，目前還沒有晶體結構報導。所以，本文採用同源模建的方式，構建了激動劑和A3R的複合物模型，並對A3R進行了一些定點突變研究，以檢驗跨膜（TM）螺旋結構域TM3、TM5、TM6、TM7和第二細胞外環2（EL2）對激動劑識別和結合的重要性。通過分子動力學模擬和MM-GBSA結合自由能計算，揭示了激動劑與A3R複合物中尚未解決的重要結構特徵。
計算方法詳解
1
模建野生型和突變型的A3R-NECA複合物結構
野生型A3R結構通過Adenosiland伺服器，以NECA-A2AR晶體結構 (PDB ID 2YDV)作為模板進行同源模建。首先，刪除A2A蛋白的溶菌酶/抗體結構域，通過YASARA軟體重構EL2和LL3結構域，在amber99sb 力場下對蛋白結構能量優化，直到達到共軛梯度小於0.05 kcal·mol1·1。優化後的A2A蛋白作為模建A3R的模板。在模建非保守區域前，先將模板的骨架原子和保守殘基的坐標保留在新的結構中，使用amber99sb力場對得到的結構最小化，直到達到共軛梯度小於0.05 kcal·mol1·1 ；在分子操作環境（MOE）中對缺失的loop結構進行重構，同時將N-和C-末端截斷，使其長度不超過晶體結構的長度，殘基被重新質子化態。最後，根據OPM資料庫將模型插入到POPC雙層膜中，利用CHARMM27力場對模型進行了45ns的MD模擬。
接下來，通過薛丁格軟體的蛋白準備頁面，對A2A R-NECA和A3 R-NECA複合物結構優化，在這個過程中，分配鍵序和二硫鍵，並添加了缺失的氫原子。此外，蛋白質模型的N-末端和C-末端分別連上乙醯基和N-甲基-氨基。使用OPLS2005力場對蛋白質進行全原子最小化，重原子均方根偏差（rmsd）值限制在0.30。旋轉A3 R-NECA 複合物的V169殘基的側鏈，來增加嘌呤環6-NH2取代的激動劑自由空間。通過野生型的A3 R-NECA 複合物結構，構建18個突變型的A3 R-NECA複合物結構。
2
選擇最優的對接方法
為了選擇一種適合A3R的分子對接方法，分別測試了GOLD的ChemScore和GoldScore打分函數，Glide的Glide SP 和 Glide XP打分函數，能否準確重現NECA在A2A R蛋白晶體中的結合構象。結果顯示，Glide的大部分docking pose中NECA的核糖結構會錯誤地朝向結合口袋的溶劑暴露區；相反，GOLD產生的大部分docking pose中NECA的核糖結構朝向蛋白內部，並且使用ChemScore打分函數，這種docking pose所佔比例最高（超過80%）。最終，選擇了GOLD/ChemScore方法對接NECA，IB-MECA到19個A3 R蛋白，每個複合體的三個得分最高的docking poses用於MD模擬。
3
MD模擬
為了選擇合適的力場，分別在OPLS005力場、amber99sb力場和CHARMM27力場下，通過300 ns的分子動力學模擬，測試了POPE雙層膜中NECA-A2AR的複合物的穩定性。結果顯示amber99sb力場表現得更好。
使用Desmond V4.9的System Builder程序將蛋白質-配體複合物插入預平衡水合膜雙層（POPE）中，POPE 雙分子層包含160種脂質，15000個Tip3p水分子，在水相中加入鈉和氯離子，中和體系電荷，正交周期盒邊界為15，原子總數約為70 000。
用desmond軟體和amber99sb力場對19個A3R-NECA和19個A3R-IB-MECA複合物進行了150ns的MD模擬。首先是對蛋白質周圍的溶劑和離子進行平衡，在10K溫度，NVT系綜，進行200ps的限制性動力學模擬，對蛋白質中的重原子(非氫原子)施加50 kcal·mol1限制力，保障平衡蛋白質周圍的溶劑分子時, 而不引起蛋白質結構的變化。然後，在NPT系綜下，將每個體系在200ps內從 10K 逐漸升溫到 310K,此時溶劑水分子採用同樣的力進行限制。升溫完成之後，對體系進行2ns的NPT平衡模擬，慢慢放開限制, 讓體系弛豫到新的狀態。完成兩個階段的預平衡後, 體系在需要的壓力與溫度下平衡好了，現在可以放開位置限制，進行150 ns的成品MD模擬。
在分子動力學模擬過程中，Particle-Mesh-Ewald(PME)方法用來處理長程靜電作用，SHAKE 算法則被用於限制所有含氫的鍵，同時，設置範德華作用和短程靜電作用的截斷值為 9。利用maestro的圖形用戶界面對產生的軌跡進行可視化，並利用desmond提供的模擬相互作用圖（sid）工具進行蛋白質-配體相互作用分析。
4
MM-GBSA 計算
對每個體系最後50ns的軌跡進行能量分析，採用薛丁格軟體的相關模塊中MM-GBSA方法評估小分子的結合力。在計算之前，所有的水分子、離子和脂類都被去除，並將蛋白複合物重新放置回幾何中心。每個複合物的有效結合自由能計算通過thermal_mmgbsa.py腳本實現，本文中的結合自由能值對應於複合體的三個最高得分binding poses的MD模擬中獲得的平均值±標準偏差。
結果部分
MD模擬結果表明，激動劑通過氫鍵、範德華和π-π相互作用結合到A3腺苷受體的活性口袋中。如圖2所示， T94、S271、H272、N250殘基都可以與IB-MECA形成氫鍵相互作用；F168與IB-MECA的嘌呤芳環形成π-π相互作用；L246、I268、W185、W243、V169、L264與IB-MECA形成範德華相互作用。上述殘基除了V169、L264外，在NECA激動劑與A3腺苷受體複合物中也有類似的作用特徵。
結合突變實驗，發現激動劑結合中關鍵的殘基，並用MM-GBSA方法計算38個A3RS複合物中激動劑的結合自由能ΔGeff，發現導致激動劑活性降低的突變體的能量值明顯高於維持或增加激動劑活性的突變體，並且與實驗測定的pIC50值具有顯著的相關性（表1）。
圖2. IB-MECA(左）和NECA(右）與A3腺苷受體複合物結構圖和二維相互作用圖
圖片來源JMC
表1. IB-MECA、NECA激動劑與A3腺苷受體複合物的活性pIC50值以及結合能ΔGeff
圖片來源JMC
與受體有直接作用的殘基有T94、F168、L246、N250、I268、S271、H272，這些殘基突變成丙氨酸會降低激動劑活性；W185A、I264A突變對活性沒有影響；比較特別的是V169殘基，當突變成丙氨酸會增加IB-MECA激動劑的活性，當突變成穀氨酸對兩種激動劑都有增強作用；間接作用的殘基如L90、 M177、 M175、 I249 、I253對激動劑有雙重作用。
在許多情況下，簡單的軌跡分析足以解釋複合物的穩定性，然而一些降低激動劑活性的突變沒有明顯改變配體的結合構象，如H272A，通過計算ΔGeff，發現結合能高於野生型22 kcal mol1,說明突變體的配體結合力變弱了，解釋了活性降低的原因。表明MM-GBSA計算的ΔGeff可以作為區分活性和非活性複合物的參考。
總結
本文1研究發現，F168的π-π相互作用， L246和I268的範德華相互作用是配體結合和激活受體的必需條件。同樣，A3腺苷受體的活化通過與T94、N250、S271形成氫鍵作用來介導的；殘基H272會影響激動劑的活性，但不影響與受體的結合；V169並不是IB-MECA激動劑的A3R選擇性的來源，相反，結合口袋遠端的 EL2, TM5和TM6的殘基L90、M177，可能通過調節口袋的結構，影響激動劑的活性，這對未來設計強效和選擇靶向A3R的激動劑具有重要指導意義。
參考文獻：
Stamatis, D.; Lagarias, P.; Barkan, K.; Vrontaki, E.; Ladds, G.; Kolocouris, A., Structural Characterization of Agonist Binding to an A(3) Adenosine Receptor through Biomolecular Simulations and Mutagenesis Experiments. Journal of Medicinal Chemistry 2019, 62 (19), 8831-8846.
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