7月15日，《科學—進展》在線發表了美國萊斯大學高雪研究組與中國農業科學院深圳農業基因所左二偉研究組合作開發的新型精準單鹼基編輯工具，將使連續胞嘧啶（C）區域的精準鹼基編輯成為可能。
胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）由胞嘧啶脫氨酶和nCas9蛋白融合組成。其中，經典的胞嘧啶鹼基編輯器BE4max CBE是由鼠源脫氨酶APOBEC1、nCas9蛋白和兩個尿嘧啶糖基化酶抑制劑構成。該項研究基於結構生物學改造了一類人源脫氨酶A3G, 並用其替代BE4max CBE中的鼠源脫氨酶，使A3G-CBE能夠最大程度地只編輯靶向鹼基C而不影響與其緊鄰無關的C。
單鹼基編輯面臨精度挑戰
左二偉告訴《中國科學報》，與傳統基因編輯策略相比，基於CRISPR/Cas9系統的DNA單鹼基編輯技術不會產生DNA雙鏈斷裂, 因此避免了由易錯DNA修復通路所引入的隨機序列插入和刪除（Indels），從而極大地提高了編輯效率和產物純度，為基因編輯應用在遺傳疾病的基礎研究和治療帶來了曙光。
胞嘧啶鹼基編輯器能夠在靶基因座上高效地進行胞嘧啶到胸腺嘧啶（C-to-T）的轉換，並已經被用於相關疾病動物模型治療研究，例如糾正由地中海貧血症。
「但是，單鹼基編輯仍然面臨精度挑戰。」左二偉舉例說，當靶向鹼基C緊鄰的鹼基也是C時, 目前的CBE鹼基編輯器很難區分它們。因為兩個相鄰的鹼基C往往都會被編輯，從而無法達到精準糾正相關疾病的目的。這為使用CBE編輯器研究和治療此類遺傳疾病帶來了很大困難。
改造脫氨酶
高雪介紹，之前研究表明，野生型的人源脫氨酶A3G主要對DNA單鏈5′-CCC-3′基因組序列中的第三個C產生脫氨基作用，即由C編輯為T。因此，這種選擇性有很大潛力被用於連續C區域的精確鹼基編輯。
他們首先通過密碼子優化，將野生型的A3G用於替換BE4 max中的鼠源脫氨酶rAPOBEC1，構建出A3G-BE 2.1。
因為A3G 的N-端結構域會導致A3G單體的聚集，並阻止A3G的脫氨活性；而A3G的C端結構域本身足以脫氨。為了提高編輯效率，他們進一步構建了只保留C端結構域的A3G-BE 4.4。
高雪介紹，在細胞中的測試結果顯示，A3G-BE 2.1和A3G-BE 4.4均可有效地區分連續C區域中的靶向C和無關C，而BE4 max則無選擇性地將兩個連續的C全部編輯。
為了進一步提高A3G-BE的編輯效率，他們通過分析A3G的C端結構域中的關鍵胺基酸，設計了三組突變，分別用於加強脫氨催化活性，增加ssDNA結合親和性，提高蛋白質溶解度。
而為了保留A3G的高選擇性，研究者同時又引入Y315F來提升非特異性DNA結合，從而最終優化得到了A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14。其中，A3G-BE5.13的鹼基編輯活性稍高，A3G-BE5.14的選擇性稍高。「兩種新CBE可以在不同情形的多C編輯中互補。」左二偉說。
Y315（綠色）與ssDNA相互作用的放大視圖。DNA主鏈5′磷酸基與Tyr315羥基之間的氫鍵，以及它們之間的相互作用 靶胞苷（dC0）和Y315的環用虛線表示。左二偉供圖
準確性安全性俱佳
為了驗證改造後的A3G-BE，他們將A3G-BE 4.4、A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14用於在細胞系中構建疾病模型和校正單鹼基突變疾病，並與BE4max相比較。
左二偉介紹，結果顯示，改造後三種A3G-CBE能夠選擇性地對5′-CC-3′序列中第二個C而非第一個C進行編輯，明顯區分了靶向C和無關C，並生成了高佔比的目標基因型，而BE4max則無法產生理想的靶向C編輯結果。
值得注意的是，A3G-BE5.14在生成轉甲狀腺素模型澱粉樣變的疾病模型的效率比BE4max 高613倍，更突出了其精確性的優勢。
而在疾病模型的測試中，A3G-BE4.4以大於50%的靶向C編輯效率高效校正了導致全羧化酶合成酶缺乏症的單鹼基突變，並且沒有對鄰近無關的C產生編輯。其產生理想校正基因型的能力比BE4max高6496倍。
「與BE4max CBE相比，A3G-CBE在糾正相關單鹼基突變疾病的能力提高得非常顯著。」高雪說。
為了研究A3G-CBE的安全性，他們還通過RNA測序和全基因組測序進行脫靶編輯的表徵。結果顯示，靶向編輯活性較高的A3G-BE 5.13與對照nCas9的脫靶水平相當，沒有顯著脫靶效應。
這些結果進一步證明，A3G-CBEs具有很高的應用價值，有很大希望被用於單鹼基突變遺傳疾病的體內治療研究。這項研究進一步加快了精準鹼基編輯邁向臨床應用的步伐。