CHO細胞工程的藝術:全面回顧與展望

原標題：CHO細胞工程的藝術：全面回顧與展望

摘要：中華倉鼠卵巢細胞（CHO）是治療性重組蛋白工業化生產的主要宿主細胞。CHO細胞能夠生產高質量的生物製劑，其與人相似的翻譯後修飾水平能夠達到克級。然而，利用動物細胞生產生物藥的過程仍然遭受許多制約，如生長限制、低產率、低耐壓以及與大腸桿菌的酵母表達系統相比的高成本。除了生物過程、培養基以及載體的優化之外，先進的宿主細胞工程技術已經在CHO細胞系發展中展現了卓越的成效，如工程基因的引入、敲出、翻譯後沉默。此外，通過對細胞代謝途徑以及對生物過程重要的機制分析，運用基因組學工具，逐步揭開新靶點用於建立優秀的生產用細胞工廠。本綜述全面總結了過去三十年中CHO細胞工程的主要基礎性成就。最後，作者討論了新穎方法論對加強基於CHO生產平臺的生物藥物生產的潛能。

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介紹

生物製藥在製藥行業所佔比重日益增加，並且在未來數十年中，市場對生物製品的需求也在不斷增加。由此而論，大多數符合工業要求的用於表達重組蛋白的生產細胞株就顯得尤為重要。重組蛋白的有效性和免疫原形直接與翻譯後修飾（PTMs）相關。動物細胞系是優先選擇的表達系統，並且如今60%-70%的生物藥物是基於動物細胞培養過程而來。並且，相較於以微生物和酵母作為宿主細胞的生產過程，動物細胞表達系統在細胞生長、培養時間以及產率方面仍有很多瓶頸。

用於生物藥物生產的CHO細胞工廠的穩步發展，是在滿足治療性蛋白日益增長的需求方面的關鍵挑戰。醫療對生物藥物日益增長的需求，使得醫保系統面臨著極大的花費。生物藥物工業化生產與不昂貴和高產的細胞生產平臺高度相關，以此得到產率最大化同時降低相關費用。因此，全新的策略已經發展並被應用到動物細胞培養過程，以滿足成本效益和有效的高產。一般會有不同的方法來抵消動物細胞工廠的限制。生物過程和培養基的優化，可以得到生長特性的提高，從而導致細胞增殖的提高和/或者最大活細胞密度（VCD）的提高。此外，通過基因工程的手段來提高CHO生產細胞株的性能，已經是被大量應用於細胞工廠的方法。這種方法一般包括優勢基因的過表達或者通過基因敲出以及siRNA介導的敲出技術來抑制不利基因的產物。值得注意的是，非編碼RNAs目前已經成為最先進的細胞工程技術，在未來細胞系的發展中展現出革命性的極大潛力。這些成就能夠使CHO細胞改造柱在生長、細胞凋亡抑制、新陳代謝、產率以及表達糖基化重組蛋白的能力方面勝過它們的母細胞株（Fig 1）。因此，宿主細胞工程在顯著提高基於CHO細胞生產過程的有效性方面，代表了一種強有力的技術。接下來的三章主要講述了在過去三十年中CHO細胞工程功能性基因組學方法的全面概括。此外，我們同樣介紹了那些能夠增強CHO細胞性能從而在未來建立出眾的高產生產過程的最新和最前沿的技術。

圖1: CHO細胞工程的功能性基因組學

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中華倉鼠卵巢細胞

相較於其他細胞類型，CHO細胞是治療性蛋白生產的主要宿主細胞的原因如下：（1）能在化學成分限定和無血清懸浮培養中穩定生長，（2）在人類致病病毒應答方面表現出合理的安全性，（3）能夠表達與人相似的翻譯後修飾。此外，CHO細胞表達系統的最重要優勢之一是能夠容易的得到基因改造的細胞克隆，這些克隆能夠表達產量充足和質量可接受的人用目標基因（GOI）蛋白。這些既可以通過將目的基因特異性位點整合插入到宿主細胞基因組中，也可以通過二氫葉酸還原酶（DHFR）和穀氨醯胺合成酶（GS）系統的基因擴增方法將基因隨機整合到宿主細胞基因組中。然而，因為糖基化模式與人類不完全相同，導致CHO細胞產生的重組蛋白在某些時候仍然表現出免疫源性。

包含多種不同細胞株的全部「CHO細胞系統」都可能來自於1956年由Theodore Puck分離的具有無性繁殖性和自發永生性的中華倉鼠卵巢細胞。第一株CHO細胞以及隨後產生的細胞株都有合成性能方面缺陷，這一事實支持了它們來自於同一個克隆的猜想。時下，有三株不同的細胞株被廣泛用於生物藥物的生產中：（1）帶有功能性DHFR基因的CHO-K1細胞系，（2）DHFR單等位基因敲除的CHO-DXB11細胞系，（3）DHFR雙等位基因物理刪除的CHO-DG44細胞系。

在2011年，Xu及其工作夥伴將第一個CHO基因組測序，這顯著加速了生物技術在研究成果上的應用。然而，因為CHO細胞極容易基因重組，進一步的測序成果包括可預測的染色體排序，是在基因組學領域得到更詳盡概述的必要條件。除了基因組學信息外，近來轉錄組、小RNA組（miRnome不知翻譯對否）以及蛋白組/翻譯組數據也成為可能。最近，轉錄起始位點被解開，一旦這些起始位點在CHO基因組資料庫（www.chogenome.org）中可以公開查閱，人們將會得到更多更詳盡的生物學信息學的分析。總體上，所有這些有價值的貢獻都有助於我們更好的描述生物技術的主導部分，以及對細胞工程中研究成果的全面支持。

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CHO細胞工程

3.1 工程基因介紹

利用目的基因的穩定整合來提高動物細胞系性能的技術已經有超過25年的開發歷史（Fig 2A）。一般的，當一個有優勢的目的基因被發現後，其（一般是密碼子優化）缺乏任何內含子的互補DNA（cDNA）會被分離，並且被克隆到一個動物細胞表達系統的載體上。接下來傳遞質粒DNA（pDNA），被轉染的細胞需要經過抗生素選擇性壓力來得到已經將質粒DNA穩轉到基因組上的細胞池。為了保證目的基因的高拷貝，它的表達主要依賴於強病毒或者細胞啟動子/加強子，然而標記基因一般通過弱啟動子來增加整個表達水平。所選擇的細胞培養是一個異質性的細胞混合池，它表現出多種範圍的轉染基因的過表達，並且導致個體細胞的不同表型。因此，需要從細胞池中挑選出那些具有高拷貝和穩定構建表型的單細胞克隆。一份關於通過優勢目的基因成功實施CHO細胞構建方法的清單列在表1中。

圖2: CHO細胞中通過基因工程得到的細胞功能性目標位點.

3.1.1涉及糖基化基因的過表達

雖然用CHO細胞生產的治療性蛋白主要用於人類，並且要考慮其安全性，它們可能只表現出與人相似但並不能被人體識別的翻譯後修飾（PTMs）。然而，不正確的N-糖基化模式可能導致一些免疫反應，並且可能導致單克隆抗體（mAbs）的抗體依賴的細胞毒性作用（ADCC）減弱。因此，糖基化狀態嚴重影響重組蛋白的性能，比如血清半衰期，穩定性，免疫源性和其在人體中的功能性。不同的基因工程策略已經被用於調整CHO細胞生產的重組蛋白的糖基化模式。相較於人細胞和鼠細胞，CHO細胞缺乏α-2,6-唾液酸轉移酶（ST6GAL）但是只表達α-2,3-唾液酸轉移酶（ST3GAL）。因此，CHO細胞天生不能產生與人類細胞系相似的末端唾液酸豐度。隨著對治療性蛋白複雜糖基化的需求日益增多，使研究人員在1989年就構建出了穩定過表達ST6GAL的CHO細胞株。這種構建過的細胞株能夠分泌含有α-2,6-唾液酸糖苷殘基的重組蛋白。其他被確認過表達ST6GAL基因的多種物種（人，小鼠，大鼠）確實能夠增加重組蛋白N-糖苷的唾液酸的豐度。包括N-糖基化通路中不同部分的基因共同導入的工程方面的進一步的努力，使得治療性重組蛋白的N-糖苷結構得到提高。這些包括如不同的N-乙醯基葡萄糖轉移酶（GnT-III, IV和V），尿嘧啶二磷酸-N-乙醯基葡萄糖2-異構酶（GNE），CMP-唾液酸合成酶（CMP-SAS），高爾基α-甘露糖苷酶II（ManII）或者GDP-6-脫氧-4-己酮酶還原酶（RMD）。最後，雖然在過去十年人們將主要的注意力都集中在重組蛋白的N-糖基化上，改變方向的對O-糖基化的研究表明其在CHO細胞中對功能基因代謝工程方面的潛在影響。然而，雖然N-糖基化的調整在重組蛋白治療潛能和安全性方面佔據主導作用，對O-糖基化調整的進一步研究仍然不夠詳盡。

3.1.2通過基因過表達提高細胞代謝

細胞新陳代謝相關的基因被作為目的片段通過基因工程的手段轉入細胞中，以此來提高CHO生產細胞的性能。二十年前，通過過表達特定的基因來改變CHO生產細胞的新陳代謝活性，這將延長培養周期，提高產物得率。Pendse和Bailey報導，加強CHO細胞透明顫菌血紅蛋白（VHb）的表達已被證明能夠將人組織纖溶酶原激活劑（tPA）活性提高40-100%。幾年後，其他研究組的貢獻拓展了代謝工程基因的範圍，這些基因的過表達可以優化CHO細胞在培養基中的營養物消耗以及代謝副產物的累積。值得注意的是，除了優化了工程CHO細胞的代謝活性外，大部分所提到的研究表明培養基利用率的提高到帶來產物得率的提高。

3.1.3 通過抗凋亡和促增殖基因的過表達提高培養性能

在癌症研究中，凋亡是一種十分好的特徵性細胞通路，凋亡性細胞死亡的逃逸是癌細胞的特徵。然而，在生物過程中削弱細胞凋亡，這將是十分有益於延長培養時間從而增加單位體積的產率。一些研究組已經成功證明，抗凋亡基因的過表達對CHO工程細胞的基因改造是有利的。啟發於B細胞淋巴瘤穩定細胞工廠的天然藍圖，Majors等人最近試圖通過過表達B細胞淋巴瘤XL（BCL-XL）的變異體來找到一種完善抑制細胞凋亡的策略。除了使用天然和突變的BCL-XL，研究者也利用其他一些抗凋亡基因如B細胞淋巴瘤2（BCL2），X連鎖細胞凋亡抑制蛋白（XIAP），細胞凋亡半胱天冬酶抑制劑（AVEN），Fas凋亡途徑抑制劑分子（FAIM），骨髓瘤細胞白血病1（MCL1）等（詳見表1）來提高培養周期，他們主要的作用機制是抑制由於培養後期營養缺乏和代謝副產物累積導致的細胞凋亡。值得注意的是，死細胞數與產物的損失直接相關，這些非活細胞會在培養後期釋放蛋白酶以及其他一些過程酶到培養液中，最終導致產物質量問題。最終，抗細胞凋亡工程具有極大的潛能，通過抑制胞外蛋白酶的增加來保證生產後期產物的高質量。

除此之外，培養後期的飢餓狀態也會導致CHO細胞的自我吞噬。自我吞噬是細胞利用自身細胞器和其他細胞成分來產生能量的過程。CHO細胞工程方法要同時關注自體吞噬和細胞凋亡途徑從而提高細胞活性和培養時間，並且已經報導可以通過AKT或者BCL2和BECLIN1聯合過表達的方法實現。然而，單獨通過過表達自體吞噬核心通路基因ATG9A的策略已被證明不能夠影響自體吞噬，並且這種努力並不能增加CHO細胞重組蛋白的得率。雖然自體吞噬作用在生物過程中扮演了一個重要的角色，因此它成為CHO細胞中極具希望的目標位點，其分子組成也在通過進一步的實驗進行研究。然而，這甚至可能有助於發現適合CHO細胞使用基因工程進行基因調控的新目標位點。

通過加速細胞擴增來縮短細胞生長周期，一般伴隨著比生長速率的逐漸下降，這個過程可以通過基因工程實現。以比生長速率的提高為特點的細胞量的快速積累支持著生產期的延長。與此同時，Doolan及其同事證明含纈酪肽蛋白（VCP）的強制表達能夠加強CHO生產細胞的增殖和活性。此外，其他側重於細胞周期的基因工程策略已經被用於提高重組CHO細胞的生長速率。細胞周期蛋白依賴性激酶3（CDKL3）和細胞色素C氧化酶亞基（COX15）的共同過表達可以提高最大活細胞密度（VCD）。Kuystermans 和AI Rubeai利用骨髓瘤細胞致癌基因的過表達，在不添加營養物的條件下使得CHO細胞最大細胞密度提高70%。有趣的是，其他的研究證明即使阻斷細胞周期的進行也會導致有益的影響，並且細胞周期抑制劑如p21CIP1或者p27KIP1的過表達會導致細胞周期的阻斷但是卻增加了CHO細胞的比生長速率。

3.1.4 加強基因表達提高細胞產率

最終，穩定基因組的導入促進了蛋白的生產，通過加強細胞蛋白合成組件或者分泌組件的基因表達可以增加CHO細胞培養中重組蛋白的得率。過表達轉錄因子如ZFP-TF，ATF4或者GADD34被證明可以將多種細胞重組蛋白的產量大幅度提高，甚至相較於母細胞提高10倍。另一種蛋白合成中的關鍵蛋白是哺乳動物類雷帕黴素靶蛋白（mTOR）。加強mTOR異位基因表達大幅度提高了重組CHO細胞的全部培養性能，導致細胞生長、活性、細胞凋亡抑制和比生產速率的提高。

值得注意，隨著對複雜和難表達的治療性蛋白需求的增加，優化策略需要提高以提供滿足臨床研究和市場需求的充足產品。Pybus及其同行最近報導了一種有趣的方法，其證明共同過表達熱休克蛋白70kDa 5（BIP），活化轉錄因子6C（ATF6C）以及X-box結合蛋白1（XBP1）能夠增加難表達單抗的產率。另一個解決難表達重組蛋白產率低的策略是Le等人報導的，他們過表達人信號受體蛋白14（SRP14）以此構建CHO細胞的分泌能力並且成功提高了蛋白產量。基因工程進一步的努力方向是分泌途徑，已經得到一些分泌途徑中能夠提高蛋白分泌速率且令人興奮的概念。蛋白二硫鍵異構酶（PDI），X-box連接蛋白1（XBP1），神經醯胺轉移蛋白（CERT），23 kDa突出體連接蛋白（SNAP23），囊泡連接膜蛋白8（VAMP8）或者其中的某些組合被證明能增加重組蛋白的產量。

3.2 基因敲出

除了將能夠有利於CHO生產細胞性能的目的基因過表達外，將不利基因組敲除也可作為改造宿主細胞的有效策略。有很多不同的方法可以從基因組中刪除某個基因，或者說將其功能關閉，如通過化學、放射誘導的隨機突變或者基因編輯定向突變的方法。定向基因工程擁有極高的特異性，因此優於隨機突變，特別是對於某一點的調節。同時，當今最先進的技術包括鋅指蛋白核酸酶（ZFNs），類轉錄激活劑效應物核酸酶（TALENs），大範圍核酸酶或者最近發現的基因編輯技術（CRISPR/Cas9）系統。對目標基因或者通路使用基因編輯技術來提高CHO細胞工廠的全面概述列於表2。

歷史上，使用基因操縱技術在利用CHO細胞表達生物藥物生產中取得經濟性效益的最重要之一的技術就是二氫葉酸還原酶（DHFR）基因的敲除/失活。雖然這些基因操作是通過化學突變和電離輻射得到的，不同的DHFR-缺陷株CHO細胞分別被定義為DXB11和DG44，它們是CHO細胞在生物技術領域商業化的始發性標誌。之後，另一個適合擴增的是基於穀氨醯胺合成酶（GS）系統,它能夠受到蛋氨酸二甲基代碸（MSX）的抑制，使高表達重組CHO細胞得以產生。整個適合於代謝挑選和基因擴增的CHO-GS細胞工廠，被CHO-K1SV的產生所擴增，而其來自於內源性基因GS基因的敲除。如果細胞之前曾轉染過含有DHFR或者GS基因的質粒拷貝，CHO-DXB11/DG44和CHO-GS細胞能夠分別通過穩定的轉染子在不含次黃嘌呤/胸腺嘧啶和L-穀氨醯胺的培養基中得以挑選。更重要的是，穩定轉染的細胞在不斷加壓下能夠進行基因擴增，二氫葉酸類似物氨甲喋呤（MTX）是CHO-DXB11和CHO-DG44的篩選壓力，蛋氨酸二甲基代碸（MSX）是CHO-GS的篩選壓力。

3.2.1 通過促凋亡基因的敲除抑制細胞死亡

與上述討論的抗凋亡基因的加強表達相似，對促凋亡基因的抑制也是穩定提高動物細胞培養性能的方法（Fig 2B）。永久性去除CHO細胞中BCL2-關聯X蛋白（BAX）和BCL2-拮抗物/斷路器（BAK）的表達，使用鋅指蛋白核酸酶通過抑制胱天蛋白酶活性（細胞凋亡核心酶）增加細胞凋亡抑制。這最終使單克隆抗體產量提高五倍，強調了細胞凋亡工程在重組CHO細胞中的潛能。

3.2.2 通過基因編輯調節重組蛋白的翻譯後修飾

由於PTMs在治療性蛋白中佔有重要的性能，其控制就顯得越來越重要。在提高CHO細胞生產重組蛋白的糖基化性能時所使用的不同工程方法，涉及糖基化的不同目的基因已經做了敲除研究。缺少核心巖藻糖的單克隆抗體在極低濃度下就有很強的ADCC反應。同源重組介導了穩定的α-1,6-巖藻糖轉移酶（FUT8）的基因組敲除，該酶可以催化核心巖藻糖轉移到抗體的Fc片段，從而在CHO細胞培養中消除FUT8活性。相似的，Malphettes等人利用基於鋅指蛋白的基因編輯技術將FUT8基因從基因組中敲除，得到了FUT8缺陷型CHO細胞株。最近另有研究人員將FUT8基因敲除的同時引入了抗體表達組件基因，以此來研究CHO細胞中聯合敲除/敲入技術策略的功能性。利用鋅指核酸酶的技術聯合敲除兩個不同的糖基轉移體重要基因GDP-巖藻糖（SLC35C1）和CMP-唾液酸（SLC35A1），得到一株巖藻糖和唾液酸含量低的工程CHO細胞。CHO細胞中N-乙醯葡萄糖轉移酶的基因敲除已被證明能夠產生Man5作為主要糖基化位點的糖蛋白。幹擾其他一些糖基化通路的基因被視為改造CHO細胞使其表達特定糖型重組蛋白的一種有前途的策略。Yang及其同事最近提供了一種令人印象深刻的例子，他們利用鋅指核酸酶技術敲除了重組CHO細胞中19種不同的糖基化基因，通過新型「設計CHO細胞」生產預定義糖型的糖蛋白。作者很好的詮釋了通過組合基因組編輯技術進行多種敲除組合能夠得到預期中糖基化屬性的重組蛋白，因此該基因工程技術未來有望成為熱點。

另一個翻譯後修飾胺基酸殘基影響著單克隆抗體的多變性，因此他們的質量就是CHO細胞產單克隆抗體C端醯胺化種類。Skulj等人最近演示ZFN-介導的CHO細胞中肽醯甘氨酸α-醯胺化單氧酶基因敲出，使單抗C端醯胺化明顯減少，得到更加均已化的產物。

除了用於治療性的重組蛋白，其他使用基因工程的研究已將目標定為得到特定類型糖基化的用於研究的蛋白。例如，擁有簡單均一化的糖鏈異質體被期望用於X-射線晶體解析進行結構分析。與此同時，Sealover及其同事敲除了CHO細胞中甘露糖（α-1,3-）-糖蛋白，β-1,2-N-乙醯葡萄糖轉移酶（MGAT1），得到以甘露糖-5（Man5）為主要N-連接糖基化種類的重組蛋白。相較於前面關於利用化學突變法刪除MGAT1基因的報導，ZFN-介導的MGAT1基因敲除在細胞特性如生長或者活性方面並沒有消極影響。這都支持一種觀點：精準基因編輯技術相較於化學和物理突變具有更可觀的優勢。

3.2.3 CHO細胞使用CRISPR/Cas9基因編輯技術進行複合表型敲除

使用CRISPR/Cas9的精準基因編輯技術最近被引入CHO細胞工程中進行基因敲除，顯得更易構建、更節省時間並且成本更低。因此，這項創新性方法無疑在當今細胞株的優化方面帶來革命性的改變，使動物細胞工程實現理論設計。CRISPR代表著微生物適合的免疫防禦機制，保護細胞免於外源核酸的破壞。幾年前，CRISPR/Cas9系統已被證明可以在真核細胞中作為基因編輯工具起作用，其已在多種模型生物體和真核細胞中成功應用該。CRISPR關聯Cas9基因的產物是一種RNA介導的內源性核酸酶，並且代表著該系統能夠催化DNA分裂。Cas9通過小嚮導RNA靶向基因組中特定的靶位點，其包括反式激活RNA（tracrRNA）和CRISPR-RNA（crRNA）,共同形成嵌合sgRNA複合體。crRNA序列是基因組靶向DNA序列的互補序列，因此決定了其特異性。因此，它額外需要靶點位於帶有兩個鳥氨酸的前間區序列毗鄰基因（NGG）旁邊。一旦CRISPR/Cas9-sgRNA核苷核酸蛋白複合體能夠識別靶點，它就會從PAM元件的上遊3個bp開始打開雙鏈，而PAM元件一般通過非同源性末段接合進行修復（NHEJ）。通過NHEJ的DNA修復經常導致DNA鹼基的插入和刪除，造成讀框移位使各自的基因失去功能。

這將使得CRISPR/Cas9系統在CHO細胞工程中極其有利，以更加快速的產生具有優勢特徵的完美細胞系。第一份關於CHO細胞中使用CRISPR/Cas9工具進行精準基因編輯的報告中提及了O-糖基化和N-糖基化途徑中COSMC和FUT8這兩個基因的基因破壞。此外，一個被稱為「CRISPy」的新型網絡生物信息工具也已問世，它能夠設計自定義sgRNA序列以達到敲除其他基因的目的。最近，Grav和他的同事們證明了CRISPR/Cas9能夠快速的一步敲除多個表現性。將Cas9轉染到基於螢光功能的細胞中能夠超高頻且目標專一的同時破壞FUT8，BAX和BAK。該研究明確強調了CRISPR/Cas9較TALEN或是ZFN在CHO細胞中進行多基因編輯以快速高效的創造合理的「設計師CHO細胞工廠」的優勢。

3.3 RNAi介導的基因沉默

自從在秀麗新小杆線蟲中發現了RNA幹擾，雙鏈RNA，也稱為攜帶RNA介導的基因沉默（基因拆卸）已經成為了一種細胞工程中高頻運用的技術。siRNA是具有20-25個鹼基對的雙鏈RNA，展示了對目標信使RNA完整的序列互補。外源導入的siRNA被RNase-III解旋酶解鏈並結合在Argonaute-2蛋白上，形成細胞質中RNA誘導的沉默複合物（RISC）的核心。AGO2僅代表AGO蛋白家族中具有切割能力的蛋白，目標信使RNA一旦被siRNA結合，AGO2隨即降解mRNA。雙鏈RNA的5』-末端的熱力學穩定性決定了哪條鏈作為指導鏈。儘管siRNA介導目標基因沉默是人為的，但是最近有研究表明真菌中天然存在siRNA介導目標基因沉默，這都是由於轉座子轉錄，重複序列，長loop結構或是轉錄-反轉錄等內源因素導致的。

3.3.1 抗凋亡基因的降低可改善細胞培養情況

在CHO細胞中，siRNA已被廣泛用於具體基因沉默來改善細胞凋亡、糖基化、代謝或具體生產途徑。圖2C總結了因siRNA介導的基因沉默而下調的最重要的目標基因，以提高CHO生產細胞的細胞性能。siRNA可以作為小的雙鏈RNA直接導入到細胞質中，或者由含有載體的小發卡RNA表達，由上述提到的內源性RNA幹擾機制首先將siRNA解鏈形成單鏈的siRNA。細胞凋亡是一種極其重要的細胞過程，通過調節不同凋亡途徑關鍵蛋白來進行改善。在養分枯竭或高滲透壓的介質中，穩定的siRNA介導的促凋亡基因的下調，例如BAX和BAK，已被證明可以延長CHO細胞的壽命。從而在流加培養過程中獲得更高的活細胞密度，並提高了最終幹擾素（IFNγ）的產量。在另一個不同的方法中，胱天蛋白酶-3和胱天蛋白酶-7都沉默了，並且考察了siRNA介導設計的CHO細胞在丁酸鈉處理過程中表現。在1毫摩丁酸鈉的條件下，工程細胞顯示出更高的活性和更長的培養時間，從而使得人類血小板生成素（hTPO）的產量提高了55%。Wong及其同事們在CHO細胞中對轉錄組進行分析研究，識別了4個早期凋亡信號基因在培養後期過程中表達的差異。REQUIEM和ALG2這兩個促凋亡基因被siRNA穩定下調且該工程細胞顯示出比CHO母細胞系更高抗細胞凋亡能力，從而大大提高了活細胞密度和終產物IFNγ的產量。

3.3.2 通過基因敲除調控轉錄後修飾

與穩定基因FUT8的基因敲除相似，Mori等人報導了由抗FUT8siRNA介導的FUT8信使RNA80%的下降可至少降低60%的單抗的巖藻糖基化，獲得提高了100倍的ADCC。此外，FUT8結構上的敲除去除了88%的去巖藻糖基化的抗胰島素生長因子-1受體抗體在產量上的負作用。與糖基化途徑的其他基因相關的功能缺失研究表明GMD蛋白表達的減少明顯優於FUT8基因敲除並產生了完全的非糖基化的單抗。最後，FUT8和GMD的聯合敲除也形成了ADCC加強的完全去糖基化的單抗。

另一個重要的PTM是唾液酸糖化作用。去唾液酸化的血清糖蛋白的循環半衰期明顯比唾液酸化的組分低得多。因此，改善唾液酸化作用是治療用蛋白生產的一個重要因素。CHO細胞中siRNA介導的唾液酸酶的下調降低了至少60%的活性。Ngantung及其同事能夠選擇CHO細胞系，該細胞系能夠保留重組IFNγ完整的唾液酸組分直到批培養結束。通過NEU1和NEU3這兩個唾液酸酶基因的沉默，唾液酸酶活性降低了98%，使得唾液酸含量增加了約23~33%。

3.3.3 代謝關鍵酶的下調改善了CHO細胞中重組蛋白的產量

真核表達系統的一個主要問題是培養環境隨著乳酸的積累而逐漸變酸，乳酸是丙酮酸經乳酸脫氫酶（LDH）作用產生的。乳酸導致的低pH會抑制細胞的生長。控制丙酮酸氧化成乳酸的策略包括抑制LDH。LDHA殘酶活性11-25%的降低可將乳酸生成降低到79%從而不影響細胞的增殖和產率。此外，LDH和丙酮酸脫氫激酶（PDHK）同時下調可以減少乳酸含量並且增加單位體積的抗體產率。Jeong及其同事利用另一種方法特異性敲出基因，使用LDH反義mRNA證明LDHA活性的消失，成功消除了CHO細胞培養過程中因環境酸化引起的細胞凋亡。因此，相較於沒有基因改造的對照組細胞，穩定表達LDH反義mRNA的細胞擁有低水平的線粒體功能紊亂，細胞色素C的釋放以及半胱天冬酶-3的活性。值得注意的是，近期有研究證明LDH的完全敲除對CHO細胞是致命的，甚至連PDHK-1,2,3的表達都隨之下調，這也是通過完全基因敲除策略提高部分細胞表型時值得注意的地方。

3.3.4 RNAi-介導的細胞骨架動力學和細胞周期檢測點激酶的調控

眾多研究表明動物細胞工廠產量的差異主要來自於高產株中細胞骨架的異常調控。細胞骨架動力學的影響能夠通過基因工程手段從細胞分裂，胞內物質交換，細胞穩定性和分泌方面提高產藥物細胞的表型。在重組CHO細胞基因擴增的蛋白組學方面，絲切蛋白（CFL1），一個肌動蛋白骨架的關鍵調節蛋白，被證明可以通過10倍細胞特異性的SEAP（分泌型鹼性磷酸酶）產率的增加進行下調。相應的，瞬時siRNA介導的CHO細胞中CFL1的敲除引起重組蛋白產率提高80%，而CFL1的下調分別引起細胞SEAP產率65%的提高和tPA產率47%的提高。雖然細胞骨架動力學的調節對提高CHO細胞表型有積極作用，它對動物細胞工廠基因工程方面仍有消極的作用。

因為這些調節蛋白控制著細胞周期的程序以及增值，所以需要利用宿主細胞工程將細胞周期檢測點激酶以及其他目標靶點得以處理。Lee及其同事最近報導了一個令人興奮地研究，通過RNA幹擾技術將CHO DG44細胞中的細胞周期檢測位點激酶共濟失調毛細血管擴張以及Rad3相關表達沉默。產單抗CHO細胞中ATR的下調可以使利用MTX篩選克隆的速度加快。作為處理細胞中MTX介導的DNA複製壓力的結果，細胞周期檢測點調節子如ATR會抑制細胞周期。結合這一點，加速細胞修復的可行性被如下事實證明：ATR抑制劑能夠抑制MTX介導的細胞周期阻斷。

3.4 依賴microRNAs的細胞通路工程

在過去的幾十年，產生物醫藥產品的細胞基因工程一直關注於操縱信號目的基因。然而對於細胞表型的改變，一般通過改變多個相關的相同或不同通路的基因而不是改變單獨一個基因的表達，通過對所有信號通路的改造可能會提高表型結果。microRNAs最近被廣泛應用於CHO細胞工程中，因為這些內源性的小RNA可以調控所有的細胞通路。有趣的是，最近實驗室研究發現大部分miRNAs能夠伴隨調節多個不同的細胞通路以保持細胞內穩態。這一特性使miRNAs成為一種未來用於宿主細胞工程中的非常有效的分子工具。然而，大量的miRNAs仍然需要在CHO細胞中進行功能性評價以評價其對表型的影響。結合這一點，高通量的功能性miRNA篩選方法，miRNA組學性能學習將有助於尋找用於CHO細胞工程的新型目標分子。在接下來的部分裡，詳盡的介紹了miRNAs的生物起源和功能，以及已經報導的前沿的將miRNAs技術用於CHO細胞中的研究。

3.4.1 miRNA生物起源與功能

1993年首次在秀麗隱杆線蟲中發現嚴格調節子，miRNAs在整個多細胞生物的細胞過程中的基因表達微調方面扮演了十分重要的角色。進一步的研究證明了miRNAs的另一個附加功能，在（表觀遺傳學）轉錄基因沉默方面可以直接編輯抑制DNA啟動子的抑制子。特別的，大部分miRNAs都嚴格根據物種而進化因此表明其在細胞調控方面的重要角色。miRNA主要的基因是通過RNA聚合酶II（POLII）將其變為早期miRNA轉錄子（pri-miRNAs）而轉錄的，其包含側面含有很長上下遊基因序列的發卡結構。第一步，pri-miRNA轉錄子擁有包含DROSHA以及其輔因子DGCR8的（先天性胸腺發育不全綜合症臨界區）RNA酶-III複合物的核，DROSHA/DFCR8能夠將旁側序列分開從而產生60-80 nt長度的miRNA發卡結構前體。Pre-miRNAs通過輸出蛋白-5（XPO5）從細胞核分泌到細胞質中（Lund, 2004），另一個叫做DICER的RNA酶III將環狀序列從pre-miRNA轉移到19-25 nt的miRNA二倍中間體。隨著miRNA二倍體中間物的解螺旋，DICER將伴隨鏈轉移到途徑基因（AGO）蛋白家族成員1-4上，同時與單鏈成熟miRNA嚮導鏈結合。AGO代表微型核糖核酸酶複合物的核心蛋白，被稱為miRNA-誘導的沉默複合物（miRSC），它可以通過轉錄抑制或者mRNA降解使基因沉默。合併miRNA引導miRISC到mRNA位點，miRNA一般與3』-UTR結合從而導致翻譯後修飾基因沉默。最近研究表明miRNA目標的識別通過揭示大量的非順序miRNA：mRNA結合最終增加一個複合物到早期已知的同位miRNA功能區。目標片段不完美的天性降低了其獨立miRNA的特異性，允許單鏈miRNAs微調上百種不同目標基因。值得注意，成熟miRNA的5』-末端2-8號位點的核酸形成所謂的種子序列，它是為了與目標mRNA區域嚴格結合。擁有可識別種子區域的miRNA被編為家族。然而，來自於同一種子家族的miRNAs擁有驚人的不同的胞內功能，並且miRNA功能高度依賴於轉錄蛋白的組成，這阻礙了單獨miRNAs在功能上的分類。值得注意，大約50%的動物miRNA軌跡與其他miRNA十分接近，這使miRNA群得以產生，它們由多順反子性的轉錄單位轉錄而來。

3.4.2 CHO基因組中mRNA序列的識別

利用接下來產生的RNA測序技術，在不同CHO細胞系及培養條件下的全部RNA序列中有307個成熟miRNAs和200個pre-miR序列已經被發現。這些miRNA序列接下來被標註為cgr-miRNAs而公開發表miRNA序列信息被稱作miRBase。最近，矽膠公司對CHO基因組中的miRNA進行重新測序發現新增71個成熟miRNAs。這些發現將當今已知的成熟miRNA庫的容量增加至378個。然而，與人類和小鼠相比，較低數量的miRNAs表明灰倉鼠中的miRNAs的實際數量可能更高。在miRNAs數量上的不符合性部分原因可能是灰倉鼠（22條染色體）相較於人（46條染色體）和老鼠（40條染色體）較少的染色體造成的。此外，這也可能是CHO細胞中遺傳性基因不穩定的結果，作為miRNA序列中的單核苷酸變異體，其會導致功能的完全喪失，並且不同的CHO細胞系在同一個實驗室中進行培養也會表現出戲劇性的核型的差異。然而，基因組序列實驗也建議倉鼠和小鼠的全部基因信息具有極強的可比性。

在前基因組領域，不同的用於功能性miRNA分析的策略已經被找到，例如瞬時轉染miRNA類似物或者編碼嵌合miRNA前體發卡結構的人造表達的質粒。然而，2011年前基因組序列信息的缺失實質上阻礙了CHO細胞中miRNA的研究。而且，嵌合miRNA表達載體被證明不適用於內源性灰倉鼠中miRNA序列的載體編碼。

3.4.3 miRNA組的分析對CHO細胞中生物過程相關目的miRNAs識別的影響

一個理想的生物過程包括前期較高的細胞增殖速率而得到的較短生長期，而細胞非生長期維持的時間越久越能得到高的產率。一種常用於該目的的策略是培養過程中二階段降溫。在對數生長期的末尾降溫從而延長反應器培養時間，最終提高產物產量。對降溫積極性的評估是將miRNA建立於異種晶片上，結果顯示標準批培養的穩定期降溫能夠使miR-21和miR-24基因上調。在另一個研究中，不同的miRNAs被證明隨著溫度的降低而下調。六個miRNAs（miR-219，miR-518d，miR-126，miR-30e，miR-489以及miR-345）被證明明顯上調，四個被證明顯著下降（miR-7，miR-320，miR-101，miR-199）。Druz等人研究在新鮮以及氮源耗竭的培養基中使用異種晶片的方法進行培養的CHO細胞中不同miRNA的表達。結果表明在飢餓引起的細胞凋亡中全部miR-297-669群都被上調。特別的，miR-297-669群中28個miRNA成員中，18個miRNA被證明在培養基耗竭的條件下被上調，雖然這些數據很早就指出在CHO細胞中存在miR-297-669群，且在灰倉鼠基因組中的準確位置仍然沒有被證明，但是由於目前正在重新檢測CHO基因組中新增miRNA序列因此或許不久的將來就能夠知道具體的位置信息。在一種聯合檢測懸浮培養CHO-K1細胞中mRNA和miRNA表達的方法中，超過1400個mRNAs和100個miRNA被證明在延滯期、對數期和穩定期表達不同。最終，通過對比高產和低產細胞株中miRNA的表達，更多的miRNA被識別具有潛在調節不同蛋白的表達和分泌。這些結果強調在培養過程中轉錄組和miRNA組的動力學平衡。

3.4.4 CHO細胞中功能性miRNA的評估方法

miRNAs在動物細胞轉錄組調解中扮演著一個重要的角色，並且這是通過基因工程方法提高CHO細胞性能的候選。這有許多可考慮的依賴於miRNA的途徑，比如蛋白產生機制，分泌途徑，細胞周期，代謝以及由細胞凋亡引起的細胞死亡、壞死或者自吞噬作用。圖2D展示了早前提到的miRNAs在提高CHO細胞株性能方面的作用。為了將增加的知識用於miRNA的研究，一系列關於miRNAs功能性提高從而加強CHO細胞性能的研究得以開展。這些導致能夠對CHO細胞表型有利影響的潛在miRNAs的早期列表的形成（Table 4）。然而，由miRNA性能研究的報導數據需要統一，從而能夠進行由miRNA作用引起的理想型功能性的確認。基於運動期望模型，胞內豐富的miRNA過量或者抑制分別會導致目標基因的減少或者增加。在動物細胞培養中通過引入穩定的小RNA二倍體，被稱為miRNA類似物，能夠導致瞬時miRNAs的過表達，因此增加內源性miRNA的功能。為了增加那些對細胞特性有有利用影響的miR種類，這有幾種技術可以實現這一目標。通過整合miRNA前體序列到宿主細胞基因組上，可以實現穩定miRNA的過表達。隨著細胞的內源性miRNA生物起源途徑，導入的miRNA被轉錄並且通過結合到目的mRNAs而表現出它的調節功能。pre-miRNA序列既可以通過對宿主細胞基因組使用特異性miRNA前體的PCR方法得到，也可以通過化學法合成。miRNA序列克隆在報告基因的5』-UTR或者3』-UTR端（如GFP，抗生素抗性基因或者兩者的融合）。重要的是，序列必須滿足正確DICER過程的關鍵需求，也應該包含嚴格決定功能性的內源性loop序列。當將目標pre-miR序列亞克隆於正確的動物細胞表達載體上後，質粒DNA被轉染進入選定的重組產物的細胞株中。相較於miRNA過表達，通過使用被稱為miRNA抑制劑或者miR拮抗劑的特異性反義寡核苷酸能夠得到細胞miRNAs的短時抑制。拮抗劑是化學穩定的單鏈RNAs，它們能夠直接結合到目標miRNAs上，miRs拮抗劑是補體。內源性miRNA的穩定抑制在CHO細胞表現上具有消極作用，因此在宿主細胞優化中使用miRNA代理了一種可選擇的方法。miRNA消除或者誘導分子，它們是報告基因如綠色螢光蛋白（GFP）能夠通過3』-UTR存在於多個miRNA結合位點，能被用來穩定抑制細胞中大量存在的miRNA。二者擇一的方法用於miRNA過表達或者抑制包含病毒的載體如腺相關病毒（AAV），逆轉錄病毒或者腺病毒載體。AAV載體代表著用於基因治療最多的病毒載體，並且已經成功被用來在體內或者體外將多種基因轉換入不同的細胞中。然而，仍然沒有研究報導描述AAV載體和CHO細胞之間的相容性，其代表了轉染效率以及誘導穩定轉基因表達的能力。雖然慢病毒介導的miRNA過表達是基礎研究中常用的方法，但是在CHO細胞中過表達miRNA還沒有被報導。值得注意，我們已經能夠利用慢病毒載體快速產生穩定的miRNA過表達的CHO細胞株，既可以通過CHO細胞的穩定過表達或者抑制凋亡前體miR-137（Fischer等未出版）。然而，凋亡不能夠通過穩定敲除miR-137基因得以抑制。此外，我們不能夠建立關於凋亡前體功能miR-137-3p的穩定miRNA過表達細胞池。然而，這仍表明慢病毒轉染速率表現出很高的成功率。雖然如此，這仍表明病毒載體可能是一種用於CHO細胞miRNA研究的有價值工具以快速產生重組miRNA過表達細胞。

3.4.5 通過miRNAs調節因凋亡引起的細胞死亡

為了延長培養時間並且使細胞適應充滿壓力的反應器培養環境，迴避凋亡是一個在宿主細胞工程中經常需要達到的目標，因此也是miRNA研究的有趣課題。在上述提到的miRNA研究由Druz及其同事完成，miR-466h被發現用於誘導因處於營養缺乏培養基而飢餓的CHO細胞凋亡。因此，shRNA-介導的在CHO-SEAP細胞中凋亡前體miR-466h前體的基因敲出能夠延長培養周期並且增加活細胞密度積分，因此抑制凋亡產生的攻擊。該作者展示miR-466h前體的基因敲出導致5個抗凋亡基因的上調（BCL2L2，DAD1，BIRC6，STAT5A以及SMO）。通過目標miRNA生物信息學預測工具，發現所有這些基因都位於假定的miR-466h目標位點上的3』-UTR，表明這些基因很有可能代表著CHO細胞中miR-466h-5p的直接目標。最近，Kelly等穩定下調了CHO-SEAP細胞中凋亡前體miR-34a。出乎意料，工程細胞並沒有免於凋亡但是表現出了細胞比生長速率的增加。如miR-137所展示出的，這些結果表明穩定抑制miRNA的功能可能不會總是可以得到理想的表型。同時，新引進的基因編輯技術如CRISP/Case9系統將無疑成為一種用於穩定敲除miRNA得到優化設計的CHO細胞的有吸引力的工具。

3.4.6 miRNA-介導的重組蛋白表達的加強

Barron及其同事發現CHO細胞中miR-7a-5p表達水平隨著溫度的降低而降低。始料未及，miR-7a-5p模擬物的在CHO細胞中的導入降低了細胞增殖速度，但是增加了細胞SEAP的比生成速率。相反的，雖然CHO細胞中miR-7a-5p的瞬時抑制並沒有誘導理想表型，miR-7a的穩定抑制增加了培養周期並且因此提高了單位體積的SEAP表達水平。相似的爭論結果同樣被Loh等報導，相較於低產細胞株，在高產細胞株中發現miR-17-92a群被下調。令人意外的，miR-17-92a群成員的穩定過表達而不是抑制，能夠加強單抗的比生成速率。這些被Jadhav及其同事發現的結果線性很好，它們發現miR-17-5p的穩定過表達可以將CHO細胞中重組蛋白的表達增加三倍。Strotbek等引領了高通量miRNA的篩選方法，用於發現能夠提高CHO細胞中抗體產量的miRNAs。這種瞬時篩選能識別出好的用於增加單抗產量的miRNAs，關於人編碼miRs，has-miR-557R-557和has-miR-1287，當它們在CHO細胞中穩定過表達後能夠積極的影響生長以及細胞的比生成速率。最近，一個十分綜合性的研究顯示非預想的大量的miRNAs影響著不同的生物技術與細胞功能如蛋白生產，細胞生長、凋亡以及壞死極其相關。有趣的是，作者們報導所有的miR-30家族貢獻於加強CHO細胞中重組蛋白的表達，這甚至可以歸結於細胞比生產速率的提高。此外，miRNA的研究為CHO細胞中組蛋白脫乙醯酶（HDAC）活性的調節提供了新的視野，miR-2861的翻譯後修飾下調了CHO細胞中HDAC5的表達。因此，miR-2861被識別作為一種新的CHO細胞中的miRNA，其能夠被用來作為一種蛋白產物的加強子而對產物質量沒有負效應。此外，通過穩定沉默CHO細胞中miR-23的表達，可以調節氧化代謝和線粒體的活性，從而將SEAP蛋白的比生成產率提高三倍。識別miR-23目標基因包括LETM1和IDH1，表明miR-23能夠被用來改變CHO細胞的生物能源產生方向，為了加強重組蛋白的生產。最近被Emmerling及其同事強調，miRNA作為強有力的細胞工程工具是有極強潛力的。一個跨學科的方法，研究產rAAV的HeLa細胞以及產單抗的CHO細胞中對輕度低溫響應的不同miRNA的表達，識別出miR-483在兩個生產系統中的細胞產率關鍵調節子。然而，所有這些例子都僅僅只是大量新增miRNA中的一個開始，而那些適合於產生物藥物的宿主細胞工程的miRNAs將很快會被發現。

4

總結

30年來，基因工程一直作為功能性CHO細胞生物學中的一門強大而多功能的手段，以穩步提高CHO製造細胞的培養性能。有趣的是，儘管在2011年之前不能給CHO細胞基因組DNA測序，但是生物工程師已經通過過表達其他物種的優勢基因產物，在產生更優秀的CHO細胞系方面取得了明顯的進步，這些其他物種被認為擁有CHO細胞的保守功能。通過下一代測序，CHO和中華倉鼠基因組的破解最終促進了高效基因組編輯工具的可應用化，從而促進了定製生產CHO細胞株的發展。值得注意的是，由於近年來對CHO細胞中（小型）非編碼RNA研究的顯著增加，這一領域即將取得的成果也將充分的支持功能基因組學來提高生產型細胞，大大地增加了細胞中的工程目標。考慮到最大活細胞密度的顯著提高和大於10 g/L的體積產量部分是源於理性CHO細胞工程，所以整個細胞工程被認為是成功的。

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展望

CHO細胞工程一直以來都是被生物製藥工業的實際需求驅動的，目的是基於生物過程消除哺乳動物細胞中的阻礙。面對將來的需求，我們將面對哪些問題，如何解決這些問題來滿足工業的需求？當然，在大多數製藥公司目前的藥物中，典型的單抗藥物會漸漸地被新分子藥物所取代，比如（難以表達的）抗體片段或是人工片段，這些藥物從不可能經過數十億年的革新。這將持續挑戰CHO細胞株的開發，並且需要CHO細胞工程提供適當的解決方案。與此同時，仍然需要創新研究來維持高效的製造過程。然而，基因組編輯技術的顯著進步，如CRISPR/Cas9工具，下一代測序與系統生物技術學的結合，都在發現與調節新細胞工程目標方面展現了非凡的潛力。這些努力都將為宿主細胞的理性設計鋪平道路以滿足未來高效生物技術的需求。

參考文獻：

Fischer S, Handrick R, Otte K.The art of CHO cell engineering: A comprehensive retrospect and future perspectives.Biotechnol Adv. 2015 Dec;33(8):1878-96.

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