上海生科院在植物中實現A·T- G·C的單鹼基替換

上海生科院在植物中實現A·T- G·C的單鹼基替換

2018-02-28 上海生命科學研究院

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　　2月22日，中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組的研究論文，以Precise A·T to G·C base editing in the rice genome為題，在線發表在Molecular Plant上。該研究報導了一種新型腺嘌呤鹼基編輯器ABE7-10在水稻中的應用。它可以將水稻基因組特定位點的上A·T鹼基對高效的轉化為G·C鹼基對。此研究擴展了植物中可用的單鹼基編輯工具，並將進一步推動水稻等其他作物的分子精準育種。

　　鹼基置換突變指一個鹼基被另一個鹼基取代，是最常見的突變形式。越來越多的研究表明，大部分生物性狀的改變都存在著相關基因的突變，其中以鹼基置換突變即點突變最為常見。尋求高效的單鹼基編輯技術一直以來是植物研究的熱點和難點。2017年10月，哈佛大學David Liu實驗室在Nature上發表了題為Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage的研究論文，報導了一種新型的腺嘌呤鹼基編輯器ABE，可以將基因組中特定位點的A·T鹼基對高效的轉化為G·C鹼基對。該研究進一步擴展了目前基於CRISPR/Cas9的單鹼基編輯工具。但ABE是以大腸桿菌tRNA腺嘌呤脫氨酶為基礎，經過7輪的突變進化改造而得到的，雖然它能對哺乳動物細胞中的多個位點能夠進行高效鹼基編輯，但在植物中是否也可以高效利用尚不清楚。

　　基於哺乳動物細胞中已發表的結果，朱健康研究組在水稻中開發了一種新的腺嘌呤鹼基編輯系統。研究人員合成了野生型TadA和其突變形式TadA7-10，並將其用特定的街頭連接到Cas9（D10A）的N端，同時將VirD2的核定位信號肽（NLS）添加到Cas9（D10A）的C末端，形成ABEP1腺嘌呤鹼基編輯器。ABEP1在水稻中由玉米泛素啟動子驅動表達。研究人員首先選擇對水稻基因組中的OsSPL14和SLR1位點進行單鹼基編輯，A·T到G·C的替換的效率分別為26%和12.5%。為了證實該鹼基編輯器能夠同時對基因組多個靶位點同時進行編輯，研究設計了單個sgRNA同時靶向基因組中的多個位點。結果表明水稻基因組多個位點可以被ABEP1同時編輯。ABEP1依賴於SpCas9識別靶位點，而SpCas9識別靶位點依賴於NGG PAM序列，這限制了水稻基因組中可被編輯的位點。為了進一步擴展水稻基因組中可被編輯的位點，研究設計ABEP2腺嘌呤鹼基編輯器，其識別靶位點依賴於SaCas9。而SaCas9識別靶位點依賴於NNGRRT PAM序列。對水稻基因組的多個基因進行定點編輯表明ABEP2同樣能夠對目標位點進行高效的鹼基替換，有些位點的效率高達61.3%。同時，ABEP2可以對多個位點進行同時編輯。對所有的編輯位點測序後研究人員發現沒有任何位點產生鹼基插入、缺失或者其他形式的鹼基替換，說明腺嘌呤鹼基編輯器精確性很高。

　　結合研究組此前開發的基於APOBEC1酶的鹼基編輯器，可以在水稻基因組中實現對DNA四種不同鹼基的高效替換（A-G, T-C, C-T, G-A）。這將進一步推動水稻功能基因組研究，並對作物分子精準育種產生重大影響。

　　抗逆中心博士研究生華凱為論文第一作者，研究員朱健康為通訊作者。生物技術平臺為該研究提供了技術支持，研究工作得到中科院的資助。

　　A.水稻中兩種腺嘌呤鹼基編輯器的載體示意圖 B.OsSPL14中的靶位點示意圖，miR156結合位點由紅色字體標出 C.兩株代表性的轉基因植株的測序峰圖，黑色箭頭指示出編輯位點 D.不同sgRNA編輯效率的統計信息

　　2月22日，中國科學院上海植物逆境生物學研究中心朱健康研究組的研究論文，以Precise A·T to G·C base editing in the rice genome為題，在線發表在Molecular Plant上。該研究報導了一種新型腺嘌呤鹼基編輯器ABE7-10在水稻中的應用。它可以將水稻基因組特定位點的上A·T鹼基對高效的轉化為G·C鹼基對。此研究擴展了植物中可用的單鹼基編輯工具，並將進一步推動水稻等其他作物的分子精準育種。
　　鹼基置換突變指一個鹼基被另一個鹼基取代，是最常見的突變形式。越來越多的研究表明，大部分生物性狀的改變都存在著相關基因的突變，其中以鹼基置換突變即點突變最為常見。尋求高效的單鹼基編輯技術一直以來是植物研究的熱點和難點。2017年10月，哈佛大學David Liu實驗室在Nature上發表了題為Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage的研究論文，報導了一種新型的腺嘌呤鹼基編輯器ABE，可以將基因組中特定位點的A·T鹼基對高效的轉化為G·C鹼基對。該研究進一步擴展了目前基於CRISPR/Cas9的單鹼基編輯工具。但ABE是以大腸桿菌tRNA腺嘌呤脫氨酶為基礎，經過7輪的突變進化改造而得到的，雖然它能對哺乳動物細胞中的多個位點能夠進行高效鹼基編輯，但在植物中是否也可以高效利用尚不清楚。
　　基於哺乳動物細胞中已發表的結果，朱健康研究組在水稻中開發了一種新的腺嘌呤鹼基編輯系統。研究人員合成了野生型TadA和其突變形式TadA7-10，並將其用特定的街頭連接到Cas9（D10A）的N端，同時將VirD2的核定位信號肽（NLS）添加到Cas9（D10A）的C末端，形成ABEP1腺嘌呤鹼基編輯器。ABEP1在水稻中由玉米泛素啟動子驅動表達。研究人員首先選擇對水稻基因組中的OsSPL14和SLR1位點進行單鹼基編輯，A·T到G·C的替換的效率分別為26%和12.5%。為了證實該鹼基編輯器能夠同時對基因組多個靶位點同時進行編輯，研究設計了單個sgRNA同時靶向基因組中的多個位點。結果表明水稻基因組多個位點可以被ABEP1同時編輯。ABEP1依賴於SpCas9識別靶位點，而SpCas9識別靶位點依賴於NGG PAM序列，這限制了水稻基因組中可被編輯的位點。為了進一步擴展水稻基因組中可被編輯的位點，研究設計ABEP2腺嘌呤鹼基編輯器，其識別靶位點依賴於SaCas9。而SaCas9識別靶位點依賴於NNGRRT PAM序列。對水稻基因組的多個基因進行定點編輯表明ABEP2同樣能夠對目標位點進行高效的鹼基替換，有些位點的效率高達61.3%。同時，ABEP2可以對多個位點進行同時編輯。對所有的編輯位點測序後研究人員發現沒有任何位點產生鹼基插入、缺失或者其他形式的鹼基替換，說明腺嘌呤鹼基編輯器精確性很高。
　　結合研究組此前開發的基於APOBEC1酶的鹼基編輯器，可以在水稻基因組中實現對DNA四種不同鹼基的高效替換（A-G, T-C, C-T, G-A）。這將進一步推動水稻功能基因組研究，並對作物分子精準育種產生重大影響。
　　抗逆中心博士研究生華凱為論文第一作者，研究員朱健康為通訊作者。生物技術平臺為該研究提供了技術支持，研究工作得到中科院的資助。

　　A.水稻中兩種腺嘌呤鹼基編輯器的載體示意圖 B.OsSPL14中的靶位點示意圖，miR156結合位點由紅色字體標出 C.兩株代表性的轉基因植株的測序峰圖，黑色箭頭指示出編輯位點 D.不同sgRNA編輯效率的統計信息

列印 責任編輯：侯茜