尋常型天皰瘡患者血清對HaCaT細胞Dsg、MMP-9表達的影響

天皰瘡(pemphigus)是一種慢性自身免疫性大皰性皮膚病，典型表現為紅斑基礎上鬆弛性水皰、Nikolsky徵陽性、難愈的糜爛伴表面汙穢性褐色結痂，病理特徵為表皮內水皰且可見棘層松解細胞。依據臨床和病理表現，天皰瘡分為尋常型、紅斑型、落葉型以及增殖型天皰瘡四種類型，其發病機制主要是患者存在針對角質形成細胞(KC)橋粒芯糖蛋白(Dsg)的自身抗體IgG結合到KC誘發炎症，導致橋粒破壞和棘層分解，但詳細機制仍然未明。早期研究顯示，基質金屬蛋白酶(MMP)9可能參與了PV棘層松解過程，但詳細機制未明。謝志敏等探討PV血清對Dsg1、Dsg3、MMP-9的mRNA轉錄及蛋白表達的影響，進一步闡明天皰瘡棘層松解的機制。

作者：謝志敏1，潘喬林1，張怡2，沈旭成1，鄧慧妍1,2,戴向農1,2，葉興東1,2

作者單位：1.廣州醫科大學皮膚病研究所；2.廣州市皮膚病防治所，廣東  廣州  510095

【引文格式】謝志敏，潘喬林，張怡，等.尋常型天皰瘡患者血清對HaCaT細胞Dsg、MMP-9表達的影響[J].皮膚性病診療學雜誌，2020，27（5）:295-300,306.

【關鍵詞】尋常型天皰瘡；  基質金屬蛋白酶；  橋粒芯糖蛋白；  內吞；  棘層松解

【基金項目】廣州市科技計劃項目（編號：201904010352）

含5%PV血清的DMEM高糖培養基HaCaT細胞光鏡下形態變化

鏡下看出，細胞培養18 h後，基本長成緻密單層（圖1A），加入含5% PV血清的DMEM高糖培養基，繼續培養18 h，可見老化細胞懸浮，緻密單層細胞折光性增強，細胞間聯結減弱，細胞游離皺縮、變圓（箭頭處），胞內顆粒變大（圖1B）。

含5%PV血清的DMEM高糖培養基對HaCaT細胞Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA轉錄的影響

通過Q-PCR檢測各組HaCaT細胞在不同幹預條件下Dsg1、Dsg3和MMP-9 mRNA轉錄水平,以GADPH為內參基因，結果顯示：PV血清組、抗Dsg3單抗組中Dsg1、Dsg3mRNA相對表達量高於正常培養組及健康血清組。PV血清組MMP-9 mRNA相對表達量高於正常培養組（P=0.014），但與健康血清組比較無明顯差異（P=0.154）。與正常培養組相比，PV血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9相對表達量分別上升約432%、402%、402%，差異有統計學意義（P值均<0.05）；與抗Dsg3單抗組相比，PV血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9相對表達量無明顯差異（P值均>0.05）。詳見表2。

含5%PV血清的DMEM高糖培養基對HaCaT細胞Dsg1、Dsg3和MMP-9的影響

Western Blot結果表明：與正常培養組相比，抗Dsg3單抗組、PV血清組HaCaT細胞Dsg1、Dsg3、MMP-9 3種蛋白表達均增加，而健康血清組Dsg1、Dsg3、MMP-9表達量未見明顯差異，見圖2。

螢光單克隆抗體檢測天皰瘡患者血清對HaCaT細胞表達Dsg1、Dsg3的影響

用間接免疫螢光法檢測各組HaCaT細胞表達Dsg1、Dsg3的影響，用倒置螢光顯微鏡觀察顯示：正常培養組和健康血清組HaCaT細胞形態完整，結構類似，螢光強度基本相同，細胞膜表面可見中等強度線狀螢光，細胞核染色可見細胞核大，變圓、清晰。Dsg1螢光抗體染色可見PV血清組及抗Dsg3單抗組HaCaT細胞表面線狀螢光消失，Dsg3螢光抗體染色可見PV血清組及抗Dsg3單抗組部分HaCaT細胞表面線狀螢光仍然存在，但螢光強度均較正常培養組、健康血清組低，且有細胞核縮小、細胞間隙增寬的現象。PV血清組Dsg1及Dsg3螢光強度較抗Dsg3單抗組低。詳見圖3。

PV血清能促進Dsg1、Dsg3和MMP-9轉錄及表達，Dsg3抗體可通過誘導角質形成細胞Dsg1蛋白內吞，削弱抗體補償作用參與棘層松解。