近日，CRISPR 基因編輯奠基人 Jennifer Doudna 在 Science 雜誌發表了題為 DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor 的論文，首次解析了單鹼基編輯器 ABE8e 的超高解析度冷凍電鏡結構，揭示了 ABE8e 如何實現 DNA 上的快速脫氨，為單鹼基編輯技術的改進和安全應用提供了一條新的思路。
（來源：Science）
CRISPR/Cas 系統可以說是目前生物學界的「明星產品」。早在 30 年前，九州大學生物科學和生命技術部的 Yoshizumi Ishino 教授首次發現 CRISPR，但當時它的生物學功能還沒有被人們所認識。
CRISPR 基因編輯器的早期發展史
2000 年初，阿利坎特大學免疫和生理部的 Francisco J M Mojica 教授帶領的小組發現了 CRISPR 的間隔區與細菌病毒、古菌病毒和質粒的序列相似性，終於揭示了 CRISPR 作為免疫系統的功能。並於 2005 年由三個研究小組獨立發表在刊物上。與此同時，他們還發現早前一些編碼極端嗜熱古菌特有 DNA 修復蛋白的基因與 CRISPR 有著強烈關聯性，並將其命名為 cas (CRISPR-associated)基因。在當時，該發現的重要性顯然為世人所低估。
比較基因組分析表明，CRISPR 和 Cas 蛋白 (cas 基因產物) 實際上是一起工作的，共同構成了一個獲得性免疫系統，以保護原核細胞抵禦入侵的病毒和質粒，類似於真核生物的 RNA 幹擾 (RNAi) 系統 。因此，研究人員開始意識到，這可能成為一個非常強大的工具。
腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）是 DNA 的基本構成單元，按照 A-T、C-G 的配對形式搭建起了 DNA 的雙螺旋結構。CRISPR-Cas9 鹼基編輯器由 RNA 引導的 Cas 蛋白與一種脫氨酶融合而成。沒有任何天然的酶讓 DNA 中的腺嘌呤脫氨，因此，當天然的轉移 RNA 脫氨酶融合到 Cas9 上，並進化出一種腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）時，基因編輯界就實現了全新的突破。
將基因組 DNA 中的 A-T 鹼基對轉換為 G-C 鹼基對，將 C-G 鹼基對轉換為 T-A 鹼基對，有望糾正人類約 60% 已知致病性單鹼基變異。這種轉換可以通過 CRISPR-Cas9 鹼基編輯器，RNA 引導的 Cas 蛋白與單鏈 DNA（ssDNA）脫氨酶融合來實現。DNA 中的 A-T 到 G-C 轉換需要將腺苷脫氨為肌苷，而肌苷被細胞機制識別為鳥苷（圖 1，A 和 B）。在 DNA 沒有脫氨基酶的情況下，大腸桿菌 tRNA 腺苷脫氨酶（TadA）與 Cas9 融合，並進化成 ABE7.10，它能催化脫氧腺苷的靶向脫氨 。
ABE7.10 編碼兩個 TadA 的副本，一個 N 端野生型（WT）TadA 連接到進化的 TadA（TadA-7.10），它的 C 端連接到一個 "缺口酶"[即切割雙鏈 DNA（dsDNA）的一條鏈]版本的嗜熱鏈球菌 Cas9（nSpCas9）（圖 1C）。此後，ABE7.10 作為一種工具被廣泛應用於許多細胞類型和生物體的基因組 DNA 的脫氨。研究人員還發現 ABE7.10 變體在細胞中催化非靶向 RNA 編輯，這種活性通過 TadA-7.10 域的突變或去除 N 端 WT TadA 域而降低，生成一個截短版的 miniABEmax(圖 1.C)。
然而，無論是 ABE7.10 還是 miniABEmax，早期的腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）效率都很低，運行也緩慢。待 ABE7.10 進一步發展以後，誕生了 ABE8e，它能編碼單個 TadA 域(TadA-8e)，並與 8 個測試的 Cas 效應器廣泛兼容(圖 1.C)。
圖 1丨編輯器具體介紹（來源上述論文，Science）
ABE8e 究竟強在哪裡？
為了了解腺嘌呤鹼基編輯器（ABEs）DNA 腺嘌呤脫氨的分子基礎，亞利桑那州大學助理教授 Lapinaite 等人利用冷凍電子顯微鏡成像技術，以 3.2A 解析度解析了 ABE8e 結合 DNA 時的 3D 結構，其中用於捕獲催化構象的模擬物取代了目標腺嘌呤。這是人類首次觀察到正在工作中的單鹼基編輯器，也首次了解到融合後的 ABE 編輯器實際上仍然分相對獨立的兩個模塊在工作，這讓我們看清了 Cas9 融合蛋白的融合模式。
研究人員觀察到，脫氨酶與 CRISPR/Cas9 R - 環複合物內暴露的 DNA 結合。動力學和結構數據表明，ABE8e 催化 DNA 脫氨的速度比早期的 ABEs 快約 1100 倍，因為突變使 DNA 底物穩定在一個受限的、類似轉移 RNA 的構象中。此外，ABE8e 加速的 DNA 脫氨表明，在 CRISPR/Cas9 監控雙鏈 DNA 的過程中，可能會發生以前未觀察到的瞬時 DNA 融化。
ABE8e 的快速多轉位反式 ssDNA 脫氨動力學研究顯示，ssDNA 中的任何腺苷，包括那些被 Cas9 短暫暴露在溶劑中的腺苷，都可能被 TadA-8e 脫氨。為了探究這個想法，研究人員使用 dsDNA，其中 NTS 含有多個腺嘌呤，比較了 ABE7.10、miniABEmax 和 ABE8e 的體外編輯特性（圖 2E），發現 ABE7.10 和 miniABEmax 主要是對單個 PAM - 端腺嘌呤進行脫氨，ABE8e 則是對多個腺嘌呤進行脫氨，包括存在於 R 環雙鏈區域內的腺嘌呤(圖 2E 和圖 S10，A 和 B)。
圖 2 丨動力學分析結果（來源 Science）
此外，ABE8e 的結構數據還闡明了新版本鹼基編輯器速度更快的秘訣。研究人員發現，相比早期版本，新版本上有兩個點突變，可以使蛋白質更緊密地抓住 DNA，從而更有效地把 A 替換為 G。
至此，我們終於明白了鹼基編輯器 ABE8e 是如何在 DNA 上實現快速脫氨這一過程。這一實驗結果有望為未來的鹼基編輯器設計提供進一步的信息。