Nat Biotechnol:構建出具有自我編輯活性的DNA鹼基編輯器

2020-12-05 生物谷

2019年9月21日訊/

生物谷

BIOON/---2016年，Komor等人利用16個鹼基長的XTEN接頭（XTEN linker）將大鼠胞苷脫氨酶APOBEC1與dCas9連接在一起，從而構建出第一代鹼基編輯器（BE1）。BE1表現出大約5個核苷酸的活性窗口（activity window）：靶位點4～8。

為了增加體內編輯效率，第二代鹼基編輯器（BE2）系統除了將胞苷脫氨酶與dCas9連接在一起之外，還將鹼基切除修復抑制劑UGI與dCas9融合在一起，從而將編輯效率提高三倍，最高達到20%左右。對BE1和BE2而言，鹼基插入或刪除（insertion or deletion, indel）發生率是非常低的（<0.1%），這是因為它們並不直接切割DNA。

為了將鹼基編輯效率提高到50％以上，人們需要採取一種方法將靶DNA鏈上的鹼基編輯複製到另一條DNA鏈上。為了做到這一點，Komor等人將dCas9換為Cas9n來模擬錯配修復，從而構建出第三代鹼基編輯器（BE3）。BE3在非互補DNA鏈上產生切口，使得它在細胞看來是「新合成的」。因此，細胞使用含尿嘧啶（U）的DNA鏈作為模板來進行修復，從而複製這種鹼基編輯。

第三代鹼基編輯能夠產生複雜的產物；人們已觀察到不想要的C->G或C->A轉換，而不是始終如一的C-> T轉換。2017年，Komor等人猜測這些副產物是在鹼基切除修復期間尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）切除引起的。雖然第三代鹼基編輯器包含UNG抑制劑UGI，但是添加第二個UGI拷貝可提高鹼基編輯產物的純度。此外，Komor等人通過延長APOBEC1-Cas9n和Cas9n-UGI中的接頭長度提高了鹼基編輯產物的純度，這三項改進一起代表了第四代鹼基編輯器（BE4）。與BE3相比，BE4使得C->G和C->A基因編輯產物減少了2.3倍，並且讓indel發生率減少了2.3倍。

直到最近，鹼基編輯僅限於靶DNA鏈上的C->T轉換，或互補DNA鏈上的G->A轉換，因此BE1、BE2、BE3和BE3都屬於胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）。Gaudelli等人尋求構建腺嘌呤鹼基編輯器（ABE），它將腺嘌呤轉化為肌苷，從而導致A->G變化。他們最終成功構建出四種ABE：ABE7.10、ABE 6.3、ABE 7.8和ABE 7.9。

然而，2019年4月，Julian Grünewald等人已證實CBE和ABE也能夠誘導全轉錄組範圍內的不依賴於嚮導RNA（gRNA）的RNA鹼基編輯，並且構建出降低不想要的RNA編輯活性的SECURE-BE3變體（詳細報導參見生物谷新聞：

Nature：震驚！CRISPR鹼基編輯器能夠誘導大量的脫靶RNA編輯

）。

圖片來自Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6。

在一項新的研究中，Julian Grünewald等人描述了對SECURE-BE3變體進行結構引導的改造，其中SECURE-BE3變體具有下降的脫靶RNA編輯活性和可比較的在靶DNA編輯活性，也是迄今為止描述的最小釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9鹼基編輯器之一。相關研究結果發表在2019年9月的Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities」。

他們還測試了基於除APOBEC1以外的胞苷脫氨基酶的CBE，結果發現基於人APOBEC3A的CBE誘導大量的RNA鹼基編輯，然而基於APOBEC3A的增強型CBE6、基於人激活誘導的胞嘧啶脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase）的CBE7和基於七鰓鰻（Petromyzon marinus）胞苷脫氨酶的CBE Target-AID4誘導較少的RNA編輯。

最後，他們發現表現出RNA脫靶編輯活性的CBE和ABE也能夠對它們自身的轉錄本進行自我編輯，從而導致鹼基編輯器編碼序列出現異質性。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：Julian Grünewald et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nature Biotechnology, 2019, doi:10.1038/s41587-019-0236-6.

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