線粒體是真核細胞重要的細胞器，參與能量代謝、細胞凋亡、維持細胞內鈣鐵離子平衡及生命活動信號轉導。線粒體基因組由 37 個基因構成，編碼 13 種蛋白。
數十年間，人類發現線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變與多種人類疾病相關。目前，線粒體疾病的治療主要集中在對症治療上，尚無糾正 mtDNA 突變的技術手段。
2020 年 7 月 8 日，來自美國華盛頓大學 Joseph D. Mougous 研究組和哈佛大學 Broad 研究所基因編輯大咖 David Liu（劉如謙）研究組在 Nature 發表了題為 A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的文章，通過細菌毒素在線粒體 DNA（mtDNA）中引入特定核苷酸，實現了線粒體基因的精確編輯。
此前，針對 mtDNA 基因編輯技術 MitoTALEN 和 mtZFN 通過產生 DNA 雙鏈斷裂降解突變線粒體 DNA，致線粒體 DNA 拷貝數下降。故新的鹼基編輯器對人類線粒體疾病的研究和治療意義重大。
圖片來源：Nature
細菌毒素 DddA
Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究組把實現線粒體基因組編輯的關鍵鎖定在一種可催化核苷酸中鹼基胞嘧啶 C 轉化為尿嘧啶 U 的細菌毒素，後者屬於胞苷脫氨酶（DddA），靶向雙鏈 DNA。
DddA 全長結構域
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線粒體基因組缺乏修復雙鏈 DNA 斷裂的有效機制。與傳統線粒體基因編輯工具（核酸酶）不同，DddA 可在不引起線粒體雙鏈 DNA 斷裂的情況下將胞嘧啶 C 轉化為尿嘧啶 U，使其成為完美的線粒體基因編輯工具內核。
胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 的搭建
胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 由線粒體靶向信號序列、TALE 蛋白、DddA 半體及尿嘧啶糖基化酶抑制劑 UGI 共同組成。
由線粒體靶向信號序列、TALE、半體 DddA 及尿嘧啶糖基化酶抑制劑 UGI 組成胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE
DdCBE 搭建及工作原理
圖片來源：Nature
DddA 屬於胞苷脫氨酶，全長 DddA 對人 HEK293T 細胞具有毒性作用。基於解析的 DddA 蛋白三維結構，研究人員將其拆分為 DddAtox-N 和 DddAtox-C 兩個 split-DddAtox 半體。
DddA 屬於胞苷脫氨酶，對人 HEK293T 細胞存在毒性
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研究人員腦洞大開將完整的 DddA 蛋白拆分為無活性的兩個 split-DddAtox 半體，G1333 或 G1397 兩個拆分位點可更好的復現 DddA 的活性
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split-DddAtox 半體與轉錄激活因子樣效應蛋白（TALE 蛋白）融合，獲得 TALE 蛋白與特定 DNA 序列結合能力。同時，兩個 TALE 蛋白與 mtDNA 結合後，split-DddAtox 半體重新聚合拼裝，恢復其鹼基編輯活性。
N 端 2x-UGI 序列和 bpNLS 核定位序列
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最後，研究團隊在基因編輯工具前端安裝了線粒體靶向信號序列，解決了胞嘧啶鹼基編輯器（DdCBE）穿越膜線粒體雙層膜的導航問題；通過 N 端安裝 2x-UGI 序列，提高了胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 約 8 倍的編輯效能（20%-27%），同時保護 DddA 轉化的尿嘧啶 U 免受尿嘧啶 - DNA 糖基化酶切割。
胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 驗證
為了驗證搭建好的 DdCBE 有效性和通用性，研究人員選擇了 5 種線粒體基因（MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 和 MT-ATP8）進行驗證。結果表明，DdCBE 在 HEK293T 細胞中展示了良好的線粒體鹼基編輯效率（隨間隔區的分裂類型、分裂方向不同在 4.6%~49%）。
DdCBE 對 mtDNA 編輯不降低細胞活力，不產生 mtDNA 缺失，不改變 mtDNA 拷貝數
圖片來源：Nature
DdCBE 脫靶效應
基因編輯工具的脫靶效應一直是限制其臨床應用的關鍵問題，也是決定其安全風險的核心要素。研究團隊隨後設計了嚴謹的實驗驗證了胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBEs 的脫靶。用來驗證脫靶的基因序列與 mtDNA 目標基因序列差異僅為 1-2 個鹼基。
研究人員證實 DdCBE 在如此嚴苛的條件下並不存在非目標基因編輯，提示 DdCBE 具有精確的鹼基識別特異性（明顯優於 CRISPR-Cas 系統），完美通過脫靶效應考核。
DdCBE 不存在非目標基因編輯
圖片來源：Nature
在同期 Nature 上，英國紐卡斯爾大學的 Magomet Aushev 和 Mary Herbert 發表了評論觀點，高度讚賞了 Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究組開發的線粒體基因編輯工具 DdCBE。
圖片來源：Nature
特約專家點評
丁香學術與 BioWorld 公眾號主編特邀西湖大學宋春青老師對此項研究進行點評。
近年來高速發展的 CIRPSR 基因編輯技術對於基因突變引起的遺傳病帶來了治癒的希望，鐮刀狀貧血等遺傳疾病基於 CRISPR 進行的治療已經進入臨床探索階段。目前開發的 CRISPR 技術主要是針對細胞核內的基因組 DNA, 我們知道除了細胞核外，還有一類遺傳物質獨立於細胞核，存在於線粒體中，稱為線粒體 DNA (mtDNA)。由於線粒體的特殊結構，基於 CRISPR 治療的外源導向 RNA（gRNA）很難進入線粒體中對 mtDNA 進行編輯。
David Liu 團隊發現了一類新的可以將胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）細菌毒素 - DddA，並通過巧妙的實驗設計，使之與轉錄激活子樣效應子陣列蛋白（TALE）和和尿嘧啶糖基化酶抑制劑融合，開發了一類不依賴於導向 RNA（gRNA）並且能夠直接催化 mtDNA 中 C・G->T・A 轉化的胞嘧啶鹼基編輯器（DdCBE）。此編輯器靶向特異性高、可以修復 49% 已知的線粒體有害基因突變，並且脫靶性低，給很多 mtDNA 突變引起的母系遺傳 Leigh 症候群、線粒體肌病等線粒體遺傳疾病的研究、治療和治癒帶來了希望。
結語
Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究組首次驗證了細菌毒素 DddA 催化真核細胞 DNA 雙鏈胞嘧啶 C 轉化為尿嘧啶 U 的基因編輯潛能，並搭建了神器胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE。
Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究組的工作亮點在於腦洞大開讓人嘆為觀止拍案叫絕的 DddA 半體「解毒」策略。
此外，頂級科學家面前不存在包括 CRISPR 禁區在內技術壁壘。神器 DdCBE 無需引導 RNA（CRISPR-free）即可在 DNA 上精準定位。他強任他強，清風拂山崗。
與此前 MitoTALEN 相比，Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究組開發的胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 不降低細胞活力，不產生 mtDNA 缺失，不改變 mtDNA 拷貝數。展示了優秀的安全性和巨大的應用前景。
圖片來源：Science
對於線粒體突變導致的人類疾病，也許正如 Science 早先評論所說，turned back the clock，古細菌可能給我們更多驚喜。
同時，神器胞嘧啶鹼基編輯器 DdCBE 也給線粒體基因病患者，帶來了希望。而萬物之中，希望至美。
圖片來源：Cell
1. Beverly Y. Mok, et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature, 2020, doi.org/10.1038/s41586-020-2477-4.
2. Magomet Aushev, Mary Herbert. Mitochondrial genome editing gets precise. Nature, 2020, doi.org/10.1038/d41586-020-01974-6.
3. Mitch Leslie. 'Old' genome editors might treat mitochondrial diseases. Science, 2018, 361(6409):1302.
4. Oliver M. Russell, et al. Mitochondrial Diseases: Hope for the FutureCell, 2020, doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.051.