《科學》：CRISPR兩大先驅合作，揭示單鹼基編輯易脫靶的原因

▎藥明康德內容團隊編輯

2012年，被喻為「上帝的手術刀」的CRISPR-Cas9系統橫空出世，短短的八年裡，這種工具已經應用到包括醫藥、農業、基礎科研等諸多領域。以經典的CRISPR-Cas9為基礎，科學家們還開發出一系列工具，例如可以轉換單個核苷酸的鹼基編輯器，以期治療單基因點突變導致的遺傳疾病。然而，這些先進的新技術並非完美，其可能的脫靶效應及潛在的安全隱患同樣十分引人關注。

日前，基因編輯領域的兩位宗師級科學家Jennifer Doudna教授和劉如謙（David Liu）教授聯手，在《科學》雜誌上報導了一種鹼基編輯器的首個詳細3D結構。「這一結構幫助我們從更深層次上理解鹼基編輯器，」加州大學伯克利分校的Doudna教授說，「我們現在可以看清它是怎麼工作的，就可以制定明智的策略來改良這個系統。」

Doudna教授與合作者在2012年發現，細菌中找到的CRISPR能用於基因組編輯。本質上看，CRISPR-Cas9是蛋白質和RNA的混合體，它們能夠精確地瞄準一段特定的DNA，然後像剪刀一樣剪開這段序列。

此後，哈佛大學和麻省理工學院Broad研究所的劉如謙教授等人開發出了首款鹼基編輯器，將經過修飾的Cas9（禁用了其DNA剪接功能）與另一種細菌蛋白（脫氨酶）結合，無需使DNA斷裂，就能定點修改基因中的單個鹼基。這種鹼基編輯器可以把DNA雙鏈上的腺嘌呤（A）-胸腺嘧啶（T）組合替換為鳥嘌呤（G）-胞嘧啶（C）組合。在人類遺傳疾病中，大約60%（超過15000種）的致病單鹼基變異有望利用現有的鹼基編輯器來糾正。

▲本研究的兩位通訊作者Jennifer Doudna教授和劉如謙教授（圖片來源：UC Berkely & Broad Institute [credit: Casey Atkins Photography]）

研究人員在論文中指出，早期的腺嘌呤鹼基編輯器（ABE）效率很低，但經過多次篩選，最新的版本ABE8e速度提高了約1100倍，能在15分鐘內完成幾乎100%的鹼基編輯工作。

但除了效率提升外，要將鹼基編輯器應用到人類遺傳疾病的治療上，科學家們還迫切想要解決「脫靶效應」，也就是針對無關DNA片段的編輯。

圖片來源：123RF
蛋白質結構一直和其功能有密切的聯繫。因此，科學家希望通過解析蛋白質結構，找出與Cas9融合的蛋白為何會產生脫靶效應，以及如何優化。「作為一個結構生物學家，我真的想看清一個分子並思考如何合理地改進它。」 共同第一作者Gavin Knott博士說道。

在最新的這篇《科學》論文中，研究人員利用冷凍電鏡技術（cryoEM），以3.2埃的解析度解析了ABE8e結合DNA時的3D結構。

「雖然鹼基編輯器現在被廣泛應用於生物體，從細菌到植物再到靈長動物，進行精確修飾，但目前為止還沒有人觀察到鹼基編輯器的三維分子結構，」劉如謙教授說，「這個合作項目揭示了一個美麗的分子結構：先進的、高度活躍的鹼基編輯器ABE8e在與目標DNA位點接觸時被捕獲的瞬間。」

▲鹼基編輯器的三維分子結構示意圖：結合在目標DNA（青色和藍色雙螺旋）上的Cas9蛋白（白色和灰色）與脫氨酶（紅色和粉色）把一個核苷酸轉換成另一個（ 圖片來源：參考資料[2]；Credit：UC Berkeley，Gavin Knott）

「這讓我們第一次看到，鹼基編輯器以兩個獨立模塊進行工作：Cas9模塊提供特異性，還有一個催化模塊提供活性。」 論文的共同第一作者Audrone Lapinaite博士描述道。

結構學數據與酶活檢測揭示了ABE8e容易產生脫靶的原因。原來，連接在Cas9上的脫氨酶始終處於激活狀態。Cas9在細胞中找到預定目標之前，會不斷結合併釋放成百數千個DNA片段。換言之，始終處於激活狀態的脫氨酶讓Cas9變成一門容易走火的大炮，不等Cas9完全匹配到目標，就直接開炮。

這一結果為科學家們重新設計與鹼基編輯器帶來了新的洞見。"如果想設計真正的特異性融合蛋白，必須找到一種方法使其催化結構域完全成為Cas9的一部分，這樣才不會一直處於活躍狀態，而是只有在Cas9正確結合到目標後才被激活。」 Lapinaite博士說。

此外，ABE8e的結構數據還闡明了新版本鹼基編輯器速度更快的秘訣。研究人員發現，相比早期版本，新版本上有兩個點突變，可以使蛋白質更緊密地抓住DNA，從而更有效地把A替換為G。
「這種結構和相應的生物化學讓人興奮。我們現在可以對這個系統在細胞中的表現作出理性的預測。」Knott博士補充道。

研究人員指出，這項新研究展示了Cas9融合蛋白的首個結構，因此其結果將為眾多從Cas9衍生的基因編輯工具提供設計指導，有助於帶來更方便、更可控、更有臨床應用價值的基因編輯工具。我們期待進一步改良的鹼基編輯系統，可以在不遠的將來為遺傳病患者帶來治療希望。

參考資料：

[1] Audrone Lapinaite et al (2020) DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor Science DOI: 10.1126/science.abb1390[2] New understanding of CRISPR-Cas9 tool could improve gene editing. Retrieved Aug 1, 2020, from https://news.berkeley.edu/2020/07/30/new-understanding-of-crispr-cas9-tool-could-improve-gene-editing/