Nat Comm | 單鹼基編輯工具ABE的協同優化 ​

2020-11-19 BioArt

撰文 | 木蘭之枻

責編 | 酶美


人類的致病遺傳變異以點突變為主，這其中G·C--A·T點突變的比例接近一半【1】。研究者新近開發的新型單鹼基編輯工具ABE（Adenine Base Editor）可有效誘導A·T--G·C點突變，這為G·C--A·T致病點突變相關疾病的治療提供了有力武器，因而在基因治療領域有著廣闊的應用前景【2】。但初始的ABE工具活性窗口非常有限且在RNA水平有嚴重的脫靶風險，這極大的限制了其應用。近年來，研究者一方面通過改換識別不同PAM位點的Cas9蛋白或是環化排列的Cas9變體（CP-Cas9）拓展了ABE工具的活性窗口【3】；另一方面則通過脫氨基酶點突變等策略有效降低了ABE工具在RNA水平的脫靶風險，改善了ABE系統的安全性【4-7】。雖然如此，已有研究難以兼顧活性窗口和RNA脫靶風險，目前也缺少合適的策略能針對ABE工具的活性窗口和RNA脫靶風險進行協同優化，這導致安全性高的ABE工具常受限於活性窗口而難以廣泛應用。


2020年11月17日，復旦大學腦科學轉化研究院程田林實驗室與中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）仇子龍實驗室及復旦大學附屬中山醫院王小林實驗室合作在Nature Communications雜誌上發表了題為Docking sites inside Cas9 for adenine base editing diversification and RNA off-target elimination的論文。研究改變融合策略，通過將腺嘌呤脫氨酶融合於Cas9內部特定位點的方式，實現了ABE工具活性窗口和RNA脫靶風險的協同優化。此外，研究者將內部融合策略與脫氨基酶點突變相結合，在保持ABE工具活性窗口多樣性的基礎上，進一步降低甚至消除了RNA水平的脫靶風險。



傳統上，ABE工具的構建是將腺嘌呤脫氨酶融合於Cas9蛋白的N末端。研究者則改變策略，嘗試在Cas9蛋白的內部篩選合適的融合位點以優化ABE工具。結果發現24處內部融合位點中，有11處位點可獲得功能性的ABE突變體（ABE-nSpCas9-DSs）（圖1）。研究進一步指出，根據活性窗口的差異，新的ABE突變體可分為兩大類，一類與傳統的ABE工具相似，其活性窗口主要位於A4-A7（PAM位點為21-23）；另一大類的活性窗口則明顯後移，在A9-A16處有更高的活性，這突破了已有研究中ABE活性窗口的局限性，極大的豐富了ABE工具活性窗口的多樣性。


圖1 可獲得功能性ABE突變體的SpCas9蛋白內部融合位點


研究還發現，內部融合不僅能增加ABE工具活性窗口的多樣性，還能有效降低其在RNA水平的脫靶風險。而將內部融合與腺嘌呤脫氨基酶點突變相結合，研究者甚至可以完全消除ABE突變體在RNA水平的脫靶風險並同時保持其活性窗口的多樣性。（圖2）


圖2 內部融合與腺嘌呤脫氨基酶點突變相結合的策略可實現ABE活性窗口和RNA脫靶風險的協同優化


此外，本研究還指出，ABE工具編輯胞嘧啶（C）的能力【8】也因融合策略的不同而發生改變。新的融合策略讓部分ABE突變體介導胞嘧啶（C）脫氨基化的窗口和序列偏好性發生了改變。這也證實了ABE系統具備用作胞嘧啶（C）編輯工具的潛力。


總體而言，程田林/仇子龍/王小林研究團隊為單鹼基編輯工具ABE在活性窗口和RNA脫靶風險兩方面的協同優化提供了全新的思路，這對提升ABE工具的安全性，拓寬其適用範圍，推動其在基因治療中的應用均有重要意義。


該研究工作主要由復旦大學附屬中山醫院李碩博士完成。復旦大學腦科學轉化研究院青年研究員程田林，中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）仇子龍研究員及復旦大學附屬中山醫院王小林教授為本文的共同通訊作者。中科院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）袁博博士，復旦大學腦科學轉化研究院陳金龍博士和邱佳怡，復旦大學類腦智能科學與技術研究院曹際新作為共同作者對本研究有重要貢獻。復旦大學類腦智能科學與技術研究院趙興明教授和陳靖祺博士對本研究亦有重要貢獻。


原文連結

http://doi.org/10.1038/s41467-020-19730-9


製版人：十一


參考文獻


1.Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet (2018).

2.Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

3.Huang TP, et al. Circularly permuted and PAM-modified Cas9 variants broaden the targeting scope of base editors. Nat Biotechnol 37, 626-631 (2019).

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