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據 ClinVar 數據顯示，人類的遺傳病中58%是由於單個鹼基突變引起的【1】。雖然Cas9激活的同源重組可以實現對突變位點的精確修正，但效率非常低（ 0.1%~5%）【2】，嚴重阻礙了其應用。而通過將胞嘧啶脫氨酶與nickase Cas9（D10A）融合而成的胞嘧啶鹼基編輯器BE3(Cytosine base editor, CBE), 在不引入 DNA 雙鏈斷裂同時也不需要重組修復模板的情況下對編輯窗口（距離PAM遠端起的第4-7位）內的胞嘧啶脫氨，實現C>T的鹼基轉換，具有更加安全、高效、精準的特點【3】。在基因治療，農作物遺傳育種，藥物篩選等領域展示了廣泛的應用前景【1】。
自CBE被報導以來，多種策略對其進行了優化改進。例如在提高活性方面，主要是通過密碼子優化及增加更強的核定位信號【4】、用高活性的胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A或 Anc689替換 APOBEC1【4,5】、融合額外的 UGI 增加編輯效率和產物純度【6,7】。而通過對脫氨酶的分子進化獲得的evoAPOBEC1-BE4max大幅提高針對GC motif中胞嘧啶的編輯效率【8】。雖然這些方法一定程度上提高了CBE的活性，但是對於編輯窗口的影響不大，特別是更靠近PAM序列的鹼基仍然很難被編輯到。因此，是否有新的策略可以提高編輯活性而又能擴增靶向鹼基的範圍，一直是鹼基編輯器優化的難點。
2020年5月11日，華東師範大學李大力課題組在Nature cell Biology發表了題為Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-strand DNA binding protein domain的研究論文，報導了一系列超高活性的胞嘧啶鹼基編輯器（hyCBE），證實其提高編輯效率、擴展編輯窗口的同時保持高效精準的工作性能。
由於CBE主要是以單鏈DNA（ssDNA）為底物，因此研究團隊猜測如果增強脫氨酶與ssDNA的結合能力，是否能增加脫氨酶作用時間而增強活性呢？於是，通過對10個非序列特異性的ssDNA結合結構域（ssDBD）與CBE進行融合，通過篩選，發現將Rad51蛋白的ssDBD融合到APOBEC1與Cas9n之間能顯著提高鹼基編輯活性，同時編輯窗口也大幅增加（圖1）。通過10個靶點的分析，在編輯窗口C4-C8中，hyBE4max比BE4max活性提高了1.5-2倍，而在C9-C15這些更靠近PAM的鹼基中，活性最多提高了18倍。
圖1. hyCBE模式圖及對不同ssDBD的篩選結果
為了驗證融合ssDBD的策略是否具有通用性，用類似的方法改造A3A-BE4max和特異性識別TC motif中C鹼基的eA3A-BE4max, 獲得了hyA3A-BE4max 和 hyeA3A-BE4max。通過大量的實驗證明，相比A3A-BE4max，hyA3A-BE4max活性在C3-C11位點提高了1.2-2倍，C12-C17位點活性提高3-4倍，通過小鼠胚胎顯微注射也進一步證明其在編輯更靠近PAM序列的鹼基的獨特優勢。與eA3A-BE4max 相比，hyeA3A-BE4max仍然能非常特異性地靶向TC motif中的C，編輯窗口由C4-9拓展為C4-15，活性最高提高了 257倍；而在小鼠胚胎中靶向Dmd基因在C13位編輯效率也大大提高，F0小鼠平均編輯活性提高了近60倍，F0代小鼠獲得DMD純合點突變的效率達到40%。
論文進一步驗證hyCBEs特別是hyeA3A沒有檢測到DNA或者RNA層面的脫靶，具有非常高的精準性。最後，通過比較多種CBE在編輯胎兒血紅蛋白（HBG1/2）啟動子-117位點的能力發現，hyeA3A能在紅細胞前體細胞系中精確催化-117G>A的轉換，而周圍同時發生鹼基突變（bystander mutation）的細胞相比，具有更高的HBG表達水平，展示了 hyeA3A-BE4max 對於精準治療β-血紅蛋白病的巨大潛力。該工作開發了能提高編輯活性拓寬靶點範圍的一系列新的CBE，為基礎研究與基因治療提供了新的優化工具。
華東師大生命科學學院2016級博士研究生張曉輝，2018級碩士研究生陳亮和2017級博士研究生朱碧云為該論文的共同第一作者，華東師範大學為第一作者單位，李大力教授為本文通訊作者，劉明耀教授對本課題給予了悉心的指導，同濟大學毛志勇教授課題組在實驗室提供了重要支持。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41556-020-0518-8
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1.Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788 (2018).
2.Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281-2308 (2013).
3.Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
4.Koblan, L.W. et al. Improving cytidine and adenine base editors by expression optimization and ancestral reconstruction. Nat Biotechnol 36, 843-846 (2018).
1980-2020
原標題：《【學術前沿】 李大力課題組開發超高活性的系列胞嘧啶鹼基編輯器（hyCBEs）》
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