Mol Cell:中科院高彩霞課題組開發出具有高特異性和高精度的胞嘧啶...

2020-12-05 生物谷

2020年8月3日訊/生物谷BIOON/---鹼基編輯器可以在不引起雙鏈DNA斷裂的情況下，在基因組DNA中產生高效的定向點突變，在人類疾病的基因治療和作物植物的性狀改良方面有很大的應用前景。

中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞（Gao Caixia）教授課題組一直在研發植物鹼基編輯技術。他們發現胞嘧啶鹼基編輯器(cytosine base editor, CBE)可誘導水稻出現意想不到的全基因組脫靶突變，這就促進全球基因組編輯界對此進行改進。

在一項新的研究中，高彩霞教授課題組基於截短的人APOBEC3胞嘧啶脫氨酶（A3Bctd）構建出兩種新的CBE，並開發出一種高通量檢測方法，用於評估植物CBE中不依賴於單向導RNA（sgRNA）的脫氨變化。相關研究結果於2020年7月27日在線發表在Molecular Cell期刊上，論文標題為「Rationally Designed APOBEC3B Cytosine Base Editors with Improved Specificity」。


他們首先開發了一種快速、高通量且廉價的方法---nSaCas9介導的正交R環測定法---來評估植物中的CBE。在這種測定法中，正交CRISPR系統nSaCas9被用於在植物細胞中產生單鏈DNA（ssDNA）區域，作為不依賴於sgRNA的脫氨變化的靶標。為了評估nSaCas9介導的正交R環測定，他們將它與全基因組測序（WGS）測定進行了比較。

一致性的結果表明，nSaCas9介導的正交R-loop測定法為評估CBE的不依賴於sgRNA的脫靶活性提供了一種合理、快速和高通量的方法。

他們隨後通過合理設計構建出16個A3Bctd脫氨酶變體，並評估了它們的在靶效率（on-target efficiency）和不依賴於sgRNA的脫靶活性。他們利用nSaCas9介導的正交R環測定法對這些A3Bctd-BE3變體進行了測試，並選擇了7個與高效的在靶編輯活性和下降的脫靶活性相關的突變。之後，他們將這些突變進行組合，產生了9個新的具有雙胺基酸或三胺基酸替換的A3Bctd-BE3變體。

通過這種方式，他們得到了兩個新的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，這兩個變體表現出高效的在靶活性和明顯下降的不依賴於sgRNA的脫靶活性。

此外，這兩種新的CBE變體在它們的靶位點上的編輯表現得更為精確，主要產生單個和兩個胞嘧啶（C）編輯。他們還通過全基因組測序驗證了A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。（生物谷 Bioon.com）

參考資料：1.Shuai Jin et al. Rationally Designed APOBEC3B Cytosine Base Editors with Improved Specificity. Molecular Cell, 2020, doi:10.1016/j.molcel.2020.07.005.

2.Researchers develop new cytosine base editors with high specificity and precision
https://phys.org/news/2020-07-cytosine-base-editors-high-specificity.html

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