中科院遺傳發育所高彩霞團隊建立鹼基編輯器特異性評估方法

2021-01-17 萊肯生物

單鹼基編輯技術可以實現目標基因組位點的鹼基替換，能夠在多種應用場景中發揮作用。然而，脫靶是其商業化應用的主要問題之一。全基因組測序（WGS）可以提供全基因組水平上的直接變異信息，能夠對編輯個體進行脫靶分析和評估，但如何將脫靶變異和背景變異區分開，是一個較難解決的問題。最近，中科院遺傳發育所高彩霞團隊詳細描述了一種無偏WGS方法，可用於精準評估水稻基因組上的鹼基編輯情況。


該方法利用高質量的參考基因組來縮小測序品種與參考序列之間的遺傳差異；利用來自同一植株的種子誘導的愈傷組織來降低植株群體內的異質性；同時對受體植物進行測序，以減少受體基因組和參考基因組的差異；以農桿菌轉化植株作為最佳對照組，以降低組培轉化對基因組的影響。


研究人員詳細描述了實驗的設計和流程，並提供了載體構建、水稻轉化和組織培養的細節，以及一個全面的WGS數據分析流程，以解決不同物種中兩個相關的核心問題：檢測群體的異質性和編輯過程的高背景突變率。研究者使用該方法可以在12-15周內直接而準確地評估鹼基編輯工具和其他基因編輯工具（例如ZFNs、TALENs、CRISPR等）在全基因組上的特異性情況。不過該方法不太適合應用於玉米、小麥等基因組大而複雜的植物上。


研究人員使用該方法對常用的胞嘧啶鹼基編輯器BE3和腺嘌呤鹼基編輯器ABE7.10的特異性進行了評估，發現BE3在全基因組水平上誘導了大量的不依賴sgRNA的脫靶C>T鹼基變異。這些脫靶鹼基變異在基因區域中富集。因此，進一步優化胞嘧啶鹼基編輯器的特異性十分必要。

Nature Protocols, 21 December 2020

An unbiased method for evaluating the genome-wide specificity of base editors in rice


Author

Shuai Jin, Qiang Gao & Caixia Gao*

*: State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Center for Genome Editing, Institute of Geneticsand Developmental Biology, Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, China


Abstract

Base editors can achieve targeted genomic base conversion. However, the off-target issue is one of the major concerns in their application. Whole-genome sequencing (WGS) at the individual level can provide direct information on genome-wide specificity, but it is difficult to distinguish true off-target single-nucleotide variants (SNVs) induced by base editors from background variation. Here we describe an unbiased WGS method for evaluating the specificity of base editors in rice. In this protocol, we describe the experimental design and provide details of vector construction, rice transformation and tissue culture, as well as a comprehensive WGS data analysis pipeline for overcoming two related core problems in various plant species: high background mutation rates and the heterogeneity of examined populations. Using this protocol, researchers can straight forwardly and accurately assess the genome-wide specificity of base editors and other genome editing tools in 12–15 weeks.

查看全文請戳下方「閱讀原文」！


相關焦點

  • 遺傳發育所首次在個體水平上發現單鹼基編輯系統存在脫靶效應
    遺傳發育所首次在個體水平上發現單鹼基編輯系統存在脫靶效應 2019-03-01 遺傳與發育生物學研究所     近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組在植物中對BE3(基於融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統)、HF1-BE3（高保真版本BE3）與ABE單鹼基編輯系統的特異性進行了全基因組水平評估，首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了這三種單鹼基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。
  • 高彩霞課題組開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊通過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計，並結合新型的胞嘧啶鹼基編輯篩選方法，開發出了新型高精度，高編輯活性的胞嘧啶鹼基編輯工具。北京時間2020年7月27日晚23時，相關論文在線發表於《分子細胞》。
  • 高精準胞嘧啶鹼基編輯工具！植物基因工程技術又進一步
    （APOBEC3B）蛋白的理性設計，並結合新型的胞嘧啶鹼基編輯篩選方法，開發出了新型高精度、高編輯活性的胞嘧啶鹼基編輯工具。高彩霞研究組長期致力於植物基因組編輯技術的創新及應用研究，已在植物中建立了完善的胞嘧啶鹼基編輯器和腺嘌呤鹼基編輯器技術體系。
  • 遺傳所開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊通過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計，並結合新型的胞嘧啶鹼基編輯篩選方法，開發出了新型高精度，高編輯活性的胞嘧啶鹼基編輯工具。北京時間2020年7月27日晚23時，相關論文在線發表於《分子細胞》。
  • ...高彩霞課題組發現胞嘧啶鹼基編輯器引發意想不到的全基因組脫靶...
    儘管CBE和ABE的在靶轉化（on-target conversion）在許多有機體中發現，但是它們的脫靶效應並未在全基因組水平上進行過系統性評估。過去對鹼基編輯特異性的分析主要局限於使用計算機軟體預測的類似靶標的位點。這些類似靶標的位點通常數量少並且具有有限的基因組分布。
  • Science:中科院高彩霞課題組發現胞嘧啶鹼基編輯器引發意想不到的...
    儘管CBE和ABE的在靶轉化（on-target conversion）在許多有機體中發現，但是它們的脫靶效應並未在全基因組水平上進行過系統性評估。過去對鹼基編輯特異性的分析主要局限於使用計算機軟體預測的類似靶標的位點。這些類似靶標的位點通常數量少並且具有有限的基因組分布。
  • 科學網—科學家開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    本報訊（見習記者韓揚眉）中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊通過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計
  • 植物腺嘌呤編輯器開發熱潮來襲
    5月30日，本公號報導了中科院遺傳發育所高彩霞團隊開發的植物腺嘌呤鹼基編輯器，成功實現了水稻和小麥基因組A→G的鹼基替換。
  • 中國科學家發現胞嘧啶單鹼基編輯器存在全基因組範圍的脫靶效應...
    中國科學家發現胞嘧啶單鹼基編輯器存在全基因組範圍的脫靶效應
  • 高彩霞/王延鵬開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具
    通過利用SaCas9切口酶產生的正交R環模擬更易受胞苷脫氨酶影響的主動轉錄的基因組位點，研究人員建立了高通量測定方法，用於評估水稻原生質體中CBE的不依賴sgRNA的脫靶效應。而且，這兩個鹼基編輯器變體通過產生較少的C編輯，在其目標位置更加精確。總之，該工作結合基於結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術，進一步提高了單鹼基編輯的精確性，開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體，為基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。
  • 「雙劍合璧」——李大力組開發新型雙鹼基基因編輯器
    STEME技術體系的建立，對於原位（In situ）定向進化植物的內源功能基因提供了新型技術支撐，對農作物分子設計育種具有重要意義。上述四個團隊以2種不同的構建策略，開發了類似功能的新型雙鹼基編輯器，都實現只有一個靶點的引導下就可以誘導靶位點C>T和A>G的同時突變。
  • Mol Cell:中科院高彩霞課題組開發出具有高特異性和高精度的胞嘧啶...
    2020年8月3日訊/生物谷BIOON/---鹼基編輯器可以在不引起雙鏈DNA斷裂的情況下，在基因組DNA中產生高效的定向點突變，在人類疾病的基因治療和作物植物的性狀改良方面有很大的應用前景。中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞（Gao Caixia）教授課題組一直在研發植物鹼基編輯技術。
  • 遺傳發育所建立基因組編輯高效調控內源基因蛋白質翻譯新方法
    遺傳發育所建立基因組編輯高效調控內源基因蛋白質翻譯新方法 2018-08-07 遺傳與發育生物學研究所 【字體CRISPR/Cas9通常在基因組靶向位點造成DNA鹼基的添加或刪除，導致基因功能的缺失。近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組建立了一個通過CRISPR/Cas9高效調控內源mRNA翻譯的方法。該方法可通過提高蛋白質翻譯效率，增加目標基因的編碼蛋白水平。　　蛋白編碼基因的表達產物一般受到轉錄、轉錄後RNA加工、蛋白質翻譯及翻譯後加工、蛋白降解等多個水平的調控。
  • 科學網— 創建新型糖基化酶鹼基編輯器
    本報訊（記者閆潔）中科院天津工業生物所研究員張學禮和畢昌昊帶領的團隊聯合攻關，創建出新型糖基化酶鹼基編輯器（GBE），
  • 一文讀懂所有的鹼基編輯器技術!
    細胞內5』flap結構易被結構特異性內切酶識別並切除，之後經DNA連接和修復便實現了精準的基因編輯。用科學網博客上的話講就是：在優化後的先導編輯中，新DNA有較高概率撬動原有序列，通過細胞自帶的鹼基修復機制連接到基因組上。而原有序列則成了多餘，被修復機制去除。至此，基因編輯功能實現，其所利用是計策可以用一個成語來概括：「鵲巢鳩佔」。
  • 遺傳發育所在作物基因組編輯育種技術方法研究中取得進展
    遺傳與變異是物種進化的基礎。通過物理、化學方法(如輻射誘變、EMS誘變)產生全基因組的隨機突變已經成為農作物育種的常規手段，但其中具有新型農藝性狀突變體的篩選較為費時、費力。因此，建立一種在植物原位進行基因飽和突變和功能篩選的定向進化新方法將有助於加快植物育種及重要功能基因研究的進程。近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組和李家洋研究組合作，構建了新型的飽和靶向內源基因突變鹼基編輯器STEME，並在植物中實現了基因的定向進化和功能篩選。
  • 新型鹼基編輯器首次在微生物中實現任意鹼基編輯
    中國科學院天津工業生物技術研究所張學禮研究員帶領的微生物代謝工程研究團隊和畢昌昊研究員帶領的合成生物技術研究團隊聯合攻關，設計構建了胞嘧啶脫氨酶-nCas9-Ung蛋白複合物，創建出新型糖基化酶鹼基編輯器（GBE），開發了可實現嘧啶和嘌呤間顛換的單鹼基基因編輯系統。基於該系統，國際上首次在微生物中實現任意鹼基編輯、在哺乳動物細胞中實現C-G鹼基特異性顛換。
  • 新型鹼基編輯器在微生物中實現任意鹼基編輯
    中國科學院天津工業生物技術研究所張學禮研究員帶領的微生物代謝工程研究團隊和畢昌昊研究員帶領的合成生物技術研究團隊聯合攻關，設計構建了胞嘧啶脫氨酶-nCas9-Ung蛋白複合物，創建出新型糖基化酶鹼基編輯器（GBE），開發了可實現嘧啶和嘌呤間轉換的單鹼基基因編輯系統。基於該系統，國際上首次在微生物中實現任意鹼基編輯、在哺乳動物細胞中實現胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的特異性轉換。
  • 張學禮/畢昌昊聯合團隊在新型鹼基編輯技術開發中取得重大突破
    中科院天津工業生物所研究員張學禮帶領的微生物代謝工程研究團隊和畢昌昊研究員帶領的合成生物技術研究團隊聯合攻關，設計構建了胞嘧啶脫氨酶-nCas9-Ung蛋白複合物，創建出新型糖基化酶鹼基編輯器（GBE），開發了可實現嘧啶和嘌呤間顛換的單鹼基基因編輯系統。基於該系統，國際上首次在微生物中實現任意鹼基編輯、在哺乳動物細胞中實現C-G鹼基特異性顛換。
  • 中科院天津工業生物所在新型鹼基編輯技術開發中取得重大突破
    中科院天津工業生物所在新型鹼基編輯技術開發中取得重大突破 中科院天津工業生物技術所官網 2020-07-22 11:38