重大進展！高彩霞/王延鵬開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具

胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）在基因組靶位點產生C-T核苷酸取代，而不會引起雙鏈斷裂。但是，諸如BE3的CBE可以通過不依賴sgRNA的DNA脫氨作用而引起全基因組脫靶變化。

2020年7月27日，中國科學院遺傳發育研究所高彩霞及王延鵬共同通訊在Molecular Cell 在線發表題為「Rationally Designed APOBEC3B Cytosine Base Editors with Improved Specificity」的研究論文，該研究通過利用SaCas9切口酶產生的正交R環模擬更易受胞苷脫氨酶影響的主動轉錄的基因組位點，研究人員建立了高通量測定方法，用於評估水稻原生質體中CBE的不依賴sgRNA的脫靶效應。水稻中10個鹼基編輯器的全基因組測序（WGS）證實了該測定的可靠性。R環測定法用於篩選一系列合理設計的A3Bctd-BE3變體，以提高特異性。該研究獲得了2個有效的CBE變體A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，WGS分析表明，這些新的CBE消除了水稻植物中不依賴sgRNA的DNA脫靶編輯。而且，這兩個鹼基編輯器變體通過產生較少的C編輯，在其目標位置更加精確。

總之，該工作結合基於結構信息的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術，進一步提高了單鹼基編輯的精確性，開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體，為基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。

胞嘧啶和腺嘌呤鹼基編輯器（CBEs和ABEs）可在基因組DNA中產生高效的目標點突變而不會引起雙鏈DNA斷裂，已用於臨床治療，農業和研究中。當前的CBE（例如BE3）將切口酶型Cas9（nCas9）蛋白與脫氨酶域和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）融合在一起，在導向RNA（gRNA）的位點催化胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉化。

先前使用全基因組測序（WGS）的研究表明，BE3誘導水稻，小鼠和人類細胞中脫靶C-to-T變化。這些突變獨立於單向導RNA（sgRNA）-Cas9編程的DNA結合，並富集在基因組的轉錄區域中。它們可能是由於胞嘧啶脫氨基酶對單鏈DNA（ssDNA）的高度親和力。這種高親和力也會影響靶標活性的精確度，因此如果靶位點內或靶位周圍存在多個胞嘧啶，大多數CBE都會產生多個C突變。這些獨立於sgRNA的脫靶編輯和旁觀者效應限制了CBE的應用。

最近，針對大腸桿菌和人類細胞，開發了幾種快速且經濟高效的方法來篩選不同CBE的不依賴sgRNA的脫氨活性。使用這些方法，發現鹼基編輯器BE4的幾種衍生物，例如EE-BE4，YE1-BE4，YE2-BE4和YEE-BE4，在人類細胞中顯示出降低的sgRNA非依賴性脫靶活性;但是，這些方法尚未在植物細胞中得到驗證。

文章模式圖（圖源自Molecular Cell ）

對於該研究，通過利用SaCas9切口酶產生的正交R環模擬更易受胞苷脫氨酶影響的主動轉錄的基因組位點，研究人員建立了高通量測定方法，用於評估水稻原生質體中CBE的不依賴sgRNA的脫靶效應。水稻中10個鹼基編輯器的全基因組測序（WGS）證實了該測定的可靠性。R環測定法用於篩選一系列合理設計的A3Bctd-BE3變體，以提高特異性。

該研究獲得了2個有效的CBE變體A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3，WGS分析表明，這些新的CBE消除了水稻植物中不依賴sgRNA的DNA脫靶編輯。而且，這兩個鹼基編輯器變體通過產生較少的C編輯，在其目標位置更加精確。

總而言之，該研究擴展了nSaCas9介導的正交R環測定法在植物中CBE的sgRNA獨立脫靶編輯活性評估中的應用，並通過WGS對其進行了驗證。該測定法能夠快速篩選一系列合理設計的A3Bctd-BE3變體，以減少不依賴sgRNA的脫靶活性，並產生A3Bctd-BE3的VHM和KKR變體，其表現出有效的C-T鹼基編輯，幾乎沒有獨立於sgRNA的脫靶活性。 本研究中提出的框架可廣泛用於評估新開發的鹼基編輯的脫靶活性以及篩選工作以開發具有更高特異性和準確性的鹼基編輯器。

參考消息：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.07.005