劉耀光院士團隊開發高效、廣靶向的植物胞嘧啶鹼基編輯器

Mol Plant | 劉耀光院士團隊開發高效、廣靶向的植物胞嘧啶鹼基編輯器PhiCBEs

責編 | 奕梵

基於CRISPR/Cas系統開發的胞嘧啶鹼基編輯器（CBEs）和腺嘌呤鹼基編輯器（ABEs）不需要供體模板以及不產生雙鏈DNA斷裂的條件下分別實現C-T（G-A）或A-G（T-C）的鹼基精準替換，為基因功能研究和遺傳改良提供了有效工具。

近日，華南農業大學生命科學學院、亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室劉耀光院士研究團隊在Molecular Plant在線發表了題為 PhieCBEs: Plant High-efficiency Cytidine Base Editors with Expanded Target Range 的研究論文，成功開發了一套高效、廣靶向的植物胞嘧啶單鹼基編輯器PhieCBEs (plant high-efficiency CBEs)。

目前已有的不同世代版本的CBE系統（BE1、BE2、BE3和BE4等）在植物細胞中的編輯效率普遍不高，且採用的來自大鼠的胞嘧啶脫氨酶rAPOBEC1的CBE對靶點序列具有偏好性，即更易於編輯TC、CC位點（下劃線為被編輯鹼基），而幾乎不編輯GC位點，因此編輯效果極不穩定。採用來自七鰓鰻魚的PmCDA1脫氨酶和來自人的APOBEC3A脫氨酶（hA3A）的編輯器在一定程度上提高了植物單鹼基編輯效率和擴大了編輯窗口。此外，一種基於靶向差異sgRNAs的代理報告系統DisSUGs，也提高了植物單鹼基編輯效率。目前大多數CBE系統是使用融合識別NGG-PAM的Cas9n變體，因此降低了基因組靶點的選擇自由度。這些因素限制了單鹼基編輯器在植物中的廣泛應用。儘管Thuronyi等人利用噬菌體輔助連續進化獲得了功能更強的進化型胞嘧啶脫氨酶（如evorAPOBEC1，evoFERNY和evoCDA1等），並與Cas9n變體融合開發了evoBE4max類型編輯器，實現了哺乳動物細胞中的無靶序列偏好性的高效胞嘧啶鹼基編輯。但是，仍不清楚這些進化型脫氨酶與靶點選擇性更廣泛的Cas9n-NG（識別NG-PAM）變體構成的CBE在植物中是否有效。

劉耀光院士團隊根據水稻密碼子偏好性重新優化了evorAPOCBEC1、evoFERNY、evoCDA1和hA3A的核苷酸序列，並將這些脫氨酶基因序列與Cas9n-NG基因融合，並在兩端加入更高效的核定位信號bpNLS，構建了四個高效的植物胞嘧啶單鹼基編輯器PhieCBEs（PevorAC1-NG、PevoFERNY-NG、PevoCDA1-NG和PhA3A-max-NG）；另外，將高保真eCas9變體進一步突變成一種新的eCas9n-NG變體（識別NG-PAM），與evoCDA1融合構建了一個新的PhieCBE PevoCDA1-eNG。以這些PhieCBEs對水稻的9個靶位點（含有NG-PAM或NGG-PAM）進行了系統的編輯效率和特徵測試。結果顯示，PhieCBEs和一種BE4編輯器（rAC1-NG）對照相比，其平均編輯效率提高了3~8倍，並消除了鹼基序列環境的偏好性，展現不同寬度的編輯窗口，和具有較低的T-DNA自靶向突變效率。其中， PevoFERNY-NG表現最突出，在NGG-PAM和NG-PAM靶點都有較高的編輯效率（40.6~82.7%，平均為62.6%），主要編輯窗口為C3~C8，產生較少的非C-T編輯副產物（2.9%），並有較低的T-DNA自靶向突變效率（6.9%）。

PhieCBEs載體的結構（A）和編輯效率（B）

綜上，該研究開發的PhieCBEs系統（特別是PevoFERNY-NG）具有高效、廣靶向、無靶序列偏好性、編輯窗口廣和自靶向編輯效率低等優點，使單鹼基編輯系統在植物中具備了實用性，能夠廣泛地用於基因功能研究、基因的飽和突變、編輯調控元件、引入提前終止密碼子、和可變剪接等研究，為植物功能基因組研究和作物遺傳改良提供了有力的工具。

華南農業大學博士後曾棟昌和研究生劉濤利為論文的共同第一作者，劉耀光院士和祝欽瀧教授為論文的通訊作者。該研究獲得廣東省基礎與應用基礎研究重大項目、國家自然科學基金項目和廣東特支計劃科技創新青年拔尖人才專項的資助。

論文連結：

https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.11.001