中科院高彩霞團隊開發出針對植物的新型可預測的多核苷酸缺失系統

許多小調控元件，包括miRNA、miRNA結合位點和順式作用元件，僅由5～24個核苷酸組成，在調控基因表達、轉錄和翻譯、蛋白結構方面發揮著重要作用，因此是基因功能研究和作物改良的理想靶點。
CRISPR-Cas9系統已在基因組工程中得到廣泛應用。在這種系統中，sgRNA引導的Cas9核酸酶產生染色體雙鏈斷裂（DSB），DSB主要通過非同源末端連接（nonhomologous end joining, NHEJ）進行修復，從而導致頻繁的長1~3 bp的短插入和缺失（indel）產生。然而，這些小 indel的異質性使得破壞這些調節性 DNA 在技術上具有挑戰性。因此，開發一種精確的、可預測的多核苷酸缺失系統對這些調節性DNA的基因功能分析和應用具有重要意義。

圖片來自Nature Biotechnology, 2020, doi:10.1038/s41587-020-0566-4

中國科學院遺傳與發育生物學研究所的高彩霞（Gao Caixia）教授及其研究團隊一直致力於開發新技術，以實現高效、特異的基因組工程。在一項新的研究中，這些研究人員基於胞嘧啶脫氨和鹼基切除修復（base excision repair, BER）機制，開發出一系列APOBEC-Cas9融合誘導缺失系統（APOBEC-Cas9 fusion-induced deletion system, AFID），將Cas9與人APOBEC3A（A3A）、尿嘧啶DNA-葡糖苷酶（UDG）和AP裂解酶結合，成功在水稻和小麥基因組中誘導出新型的精準、可預測的多核苷酸缺失。相關研究結果近期發表在Nature Biotechnology期刊上，論文標題為「Precise, predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC–Cas9」。
高教授說，「AFID-3產生了從5'-脫氨基的胞嘧啶到Cas9切割位點的多種可預測的缺失，預測的平均缺失比例超過30%。」
這些研究人員進一步篩選了水稻原生質體中不同胞嘧啶脫氨酶的脫氨活性，發現截短的APOBEC3B（A3Bctd）不僅顯示出更高的鹼基編輯效率，而且比其他脫氨酶具有更窄的窗口。
因此，他們用A3Bctd代替了AFID-3中的A3A，產生了eAFID-3。eAFID-3對雙鏈斷裂的首選TC基序產生更均勻的缺失，比AFID-3高1.52倍。
此外，這些研究人員利用這種AFID系統靶向水稻中OsSWEET14的效應物結合元件，發現可預測的缺失突變體對水稻白葉枯病的抵抗性增強了。
AFID系統優於目前其他在前間隔序列（protospacer）中產生可預測的多核苷酸靶向缺失的工具，因此有望為基礎研究和遺傳改良提供強大的缺失工具。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：
1.Shengxing Wang et al. Precise, predictable multi-nucleotide deletions in rice and wheat using APOBEC–Cas9. Nature Biotechnology, 2020, doi:10.1038/s41587-020-0566-4.
2.Scientists develop novel predictable multi-nucleotide deletion systems in plants
https://phys.org/news/2020-06-scientists-multi-nucleotide-deletion.html