2019年3月2日訊/
生物谷BIOON/---基因組編輯在治療由致命性突變引起的
遺傳疾病上有很大的潛力。對基因組編輯的脫靶效應進行全面分析是驗證這種編輯實用性所必需的。科學家們已開發出多種方法來檢測全基因組範圍內的基因編輯脫靶位點。然而，這些方法並不適用於檢測體內的單核苷酸變異（SNV）。
在一項新的研究中，中國科學院的李亦學（Yixue Li）課題組、楊輝（Hui Yang）課題組和美國史丹福大學的Lars M. Steinmetz課題組開發出一種稱為GOTI（genome-wide off-target analysis by two-cell embryo injection, 利用雙細胞胚胎注射進行全基因組脫靶分析）的方法來評估三種經常使用的基因編輯工具---CRISPR/Cas9、胞嘧啶鹼基編輯器3（BE3, rAPOBEC1-nCas9-UGI）、腺嘌呤鹼基編輯器7.10（ABE7.10, TadA-TadA*-nCas9）---誘導的脫靶效應。簡言之，這些研究人員將CRISPR/Cas9、BE3或ABE7.10與Cre mRNA一起注射到源自Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）小鼠的雙細胞胚胎的卵裂球中。在胚胎期第14.5天（ED14.5）時，基於tdTomato的表達，利用螢光活化細胞分選方法（FACS）對經過編輯的卵裂球和未經過編輯的卵裂球的後代細胞進行分選。與此同時，在ED14.5時，整個胚胎也很容易經消化後獲得足夠的單細胞。他們隨後對tdTomato陽性細胞和tdTomato陰性細胞單獨地進行全基因組測序（WGS）。以來自相同胚胎的tdTomato陰性樣本作為對照，利用三種算法對來自相同胚胎的tdTomato陽性樣本中的SNV和indel（insertion or deletion, 插入或刪除）進行研究。
圖片來自Science, 2019, doi:10.1126/science.aav9973。
在這項新的研究中，這些研究人員包括了12個組：一個Cre組（Cre-only, 僅注射Cre）、6個具有或不具有單向導RNA（sgRNA）的Cas9組（Cas9、Cas9-LacZ、Cas9-Pde6b、Cas9-Tyr-A、Cas9-Tyr-B和Cas9-Tyr-C）、三個具有或不具有sgRNA的BE3組（BE3、BE3-Tyr-C和BE3-Tyr-D）和兩個具有或不具有sgRNA的ABE組（ABE7.10和ABE7.10-Tyr-E）。首先，他們通過桑格測序（Sanger sequencing）在胚胎8細胞和ED14.5時驗證了他們的方法在胚胎中的在靶效率。為了進一步探究在靶效率和潛在的全基因組脫靶效應，他們對來自ED14.5胚胎的46個樣本進行全基因組測序，並證實Cas9、BE3和ABE7.10在tdTomato陽性細胞中高效地誘導indel和核苷酸替換。
對在靶編輯效應而言，這些研究人員在來自這12組的胚胎中僅發現0～4個indel，而且沒有一個indel與預測的脫靶位點發生重疊。對所有經過Cas9處理的胚胎而言，與Cre-only組（平均每個胚胎存在14個SNV）相比，不同的Cas9組（平均每個胚胎存在12個SNV）不存在顯著的差異。在發育期間，在經過Cre或Cas9處理的樣本中檢測到的SNV可能是由基因組複製期間的自發性突變導致的。
令人吃驚的是，這些研究人員在經過BE3處理的胚胎中，發現了平均每個胚胎存在283個SNV，這一水平至少要比在經過Cre或Cas9處理的胚胎中觀察到的高出20倍。相反之下，在經過ABE7.10處理的胚胎中，平均每個胚胎存在10個SNV，這一頻率接近於自發性突變率。他們進一步地將在BE3-only組（即僅注射BE3的組）中鑑定出的脫靶位點與在BE3-Tyr-C組或BE3-Tyr-D組中鑑定出的脫靶位點進行了比較，並發現sgRNA的存在並不誘導顯著高的SNV（P=0.21，Kruskal-Wallis test）。此外，這些變異是在tdTomato陽性細胞而不是在tdTomato陰性細胞中特異地鑑定出的。
令人關注的是，在經過BE3編輯的細胞中鑑定出的90%以上的SNV是G>A或C>T，這一突變偏好並沒有在經過Cre、Cas9或ABE7.10處理的細胞中觀察到。這一突變偏好與APOBEC1本身的突變偏好相同，這表明這些突變並不是自發的而是由BE3編輯誘導的。之前的研究已表明APOBEC家族的幾個成員（包括APOBEC1）發揮作用需要單鏈DNA。與此相一致的是，這些研究人員的分析表明由BE3誘導的SNV在轉錄區域中顯著富集，特別是在高度表達的基因中。有趣的是，這些脫靶位點中的任何一個並不與經過BE3處理的胚胎中觀察到的相同，而且也不與預測的脫靶突變發生重疊。此外，也並未在脫靶序列和靶序列之間觀察到相似性，然而，預測的排名靠前的脫靶位點與BE3的在靶位點存在著較高的序列相似性。因此，BE3引起的脫靶SNV並不依賴於sgRNA並且可能是由APOBEC1過度表達導致的。
在經過BE3處理的胚胎中觀察到的1698個SNV中，26個SNV位於外顯子中，其中的14個導致非同義變化。這些研究人員成功地將通過PCR擴增了其中的20個SNV並通過桑格測序證實了它們的存在。他們還發現1個SNV位於一個原癌基因中，13個SNV位於
腫瘤抑制基因中，這就讓人對BE3編輯的致癌風險感到擔憂。這種風險可能通過表達較低數量的BE3加以降低。然而，他們發現當表達較低數量的BE3時，在靶效率逐漸降低。
令人關注的是，這些研究人員發現大量新生突變是由BE3誘導的，這一點在之前的研究中並未報導過。一種可能的解釋就是GOTI研究了源自單個經過基因編輯的卵裂球的細胞群體，而之前的研究使用了大量的細胞群體，在那裡，編輯是可變的，而且由於細胞群體平均化，這會導致隨機的脫靶信號丟失。不同於BE3的是，ABE7.10並不導致SNV數量增加，這很可能是缺乏TadA的DNA結合能力。這些鹼基編輯器的脫靶效應可能通過降低APOBEC1的DNA結合能力或者使用不同的胞苷脫氨酶版本來加以降低。總之，GOTI可用於研究多種基因編輯工具的脫靶效應，而且不受在不同個體中存在的單核苷酸多態性（SNP）的幹擾。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Erwei Zuo et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science, 2019, doi:10.1126/science.aav9973.