強強聯合！奠基人Doudna揭示了鹼基編輯器的分子作用機制

2020-08-01 愛科學愛自然

CRISPR-Cas指導的鹼基編輯器將細胞DNA中的A•T轉換為G•C，或將C•G轉換為T•A，以進行精確的基因組編輯。在體外，ABE8e的脫氨DNA速率分別比ABE7.10和miniABEmax高590倍和1170倍。相對於WT TadA，ABE7.10和ABE8e在其進化的TadA域內分別包含14和22個胺基酸取代。這些突變如何使進化的TadA催化DNA脫氨，以及ABE7.10和ABE8e不同催化速率的分子基礎仍然未知。

2020年7月31日，美國加州大學伯克利分校Jennifer A. Doudna團隊（與David Liu團隊合作）在Science 在線發表題為「DNA capture by a CRISPR-Cas9–guided adenine base editor」的研究論文，該研究確定了ABE8e的3.2埃解析度冷凍電子顯微鏡結構，其底物結合狀態下脫氨酶結構域與CRISPR-Cas9中暴露的DNA結合 R環複合體。 動力學和結構數據表明，ABE8e催化DNA脫氨的速度比最初的ABE版本快約1100倍，這是因為突變使DNA底物以受限的tRNA樣構象穩定。 此外，ABE8e的加速DNA脫氨反應表明，以前從未觀察到的瞬時DNA退火可能在CRISPR-Cas9進行雙鏈DNA監測期間發生。 這些結果解釋了ABE8e介導的鹼基編輯結果，並為鹼基編輯器的未來設計提供了依據。

另外，2020年7月16日，美國加州大學伯克利分校Jennifer A. Doudna團隊在Science在線發表題為「CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor」的研究論文，該研究描述了一個功能最小的CRISPR-Cas系統，包括單個〜70Kd蛋白CasΦ和一個CRISPR陣列，其僅在巨大噬菌體的基因組中編碼。CasΦ使用單個活性位點進行CRISPR RNA（crRNA）加工和crRNA指導的DNA切割，以靶向外來核酸。該超緊湊型系統在體外以及在人和植物細胞中均具有活性，相對於其他CRISPR-Cas蛋白，其靶標識別能力得到了擴展。CasΦ可用於基因組編輯和DNA檢測，但分子量僅為Cas9和Cas12a基因組編輯酶的一半，為細胞傳遞提供了優勢，從而擴展了基因組編輯工具箱（點擊閱讀）。


強強聯合！奠基人Doudna揭示了鹼基編輯器的分子作用機制


基因組DNA中靶向核苷酸的編輯是研究和治療應用的一項關鍵功能。單核苷酸變體（SNV）約佔已知致病等位基因的一半，因此有針對性的點突變可以促進遺傳病的研究或潛在治療。以前，研究人員開發了胞嘧啶鹼基編輯器（CBE）和腺嘌呤鹼基編輯器（ABE），它們共同實現了所有四個過渡點突變的靶向（C→T，T→C，A→G ，以及G→A），並具有較高的期望取代率與不期望的插入和缺失（indels）比率。


基因組DNA中A•T到G•C鹼基對和C•G到T•A鹼基對的位點特異性轉化可以糾正人類中所有已知的致病性單核苷酸多態性（SNP）的60％。可以使用CRISPR-Cas9鹼基編輯器，RNA引導的Cas蛋白與單鏈DNA（ssDNA）脫氨酶融合來實現這種轉化。DNA中從A•T到G•C的轉變需要將腺苷脫氨為肌苷，這被細胞機制識別為鳥苷。由於沒有能夠將DNA中的腺嘌呤脫氨的酶，大腸桿菌tRNA腺苷脫氨酶（TadA）與Cas9融合併進化為ABE7.10，可催化脫氧腺苷的目標脫氨。


ABE7.10編碼兩個拷貝的TadA，即與進化的TadA（TadA-7.10）相連的N端野生型（WT）TadA，其在C端與「切口酶」相連。此後，ABE7.10被廣泛用作在許多細胞類型和生物中基因組DNA脫氨的工具。發現ABE7.10變體可催化細胞中的脫靶RNA編輯，其活性因TadA-7.10結構域的突變或通過去除N末端WT TadA結構域而降低，從而生成了截短的miniABEmax。


ABE7.10進一步進化為ABE8e，該ABE8e編碼與8個經過測試的Cas效應子廣泛兼容的單個TadA域（TadA-8e）。在體外，ABE8e的脫氨DNA速率分別比ABE7.10和miniABEmax高590倍和1170倍。相對於WT TadA，ABE7.10和ABE8e在其進化的TadA域內分別包含14和22個胺基酸取代。這些突變如何使進化的TadA催化DNA脫氨，以及ABE7.10和ABE8e不同催化速率的分子基礎仍然未知。


該研究確定了ABE8e的3.2埃解析度冷凍電子顯微鏡結構，其底物結合狀態下脫氨酶結構域與CRISPR-Cas9中暴露的DNA結合 R環複合體。動力學和結構數據表明，ABE8e催化DNA脫氨的速度比最初的ABE版本快約1100倍，這是因為突變使DNA底物以受限的tRNA樣構象穩定。此外，ABE8e的加速DNA脫氨反應表明，以前從未觀察到的瞬時DNA退火可能在CRISPR-Cas9進行雙鏈DNA監測期間發生。這些結果解釋了ABE8e介導的鹼基編輯結果，並為鹼基編輯器的未來設計提供了依據。


參考消息：

https://science.sciencemag.org/content/369/6503/566

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