看完這篇推文就了解色譜了

色譜（chromatography）是分析測試物質理化性質的常用的有效手段，多用於分子及高聚物的分離檢測等。分析色譜與製備色譜的區別，如下：

1、分析色譜、製備色譜的設備基礎是什麼？

分析色譜、製備色譜的共同的鼻祖是高效液相色譜(High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC)，高效液相色譜的優點是：(1)、分辯率高於其它色譜法；(2)、速度快，十幾分鐘到幾十分鐘內可完成；(3)、實驗重複性高；(4)、高效相色譜柱可反覆使用；(5)、自動化操作，分析精確度高。

根據用途不一樣，逐漸區分出來：分析型用來做樣品定性，純度檢測的，即為分析色譜；製備型是用來快速分離和純化產品的，即為製備色譜。

2、分離純化量上，如何區別，分析色譜與製備色譜？

滿足常規儀器分析，所需要的純樣品的量：(1)、NMR：1-10 mg；FT-IR：0.1-1 mg；IR：1 mg；UV-Vis：＜ 1 mg；元素分析：1-10 mg；MS：0.01-1 mg；全面鑑定一樣品結構：10-50 mg。

分析色譜：要求分離度高、速度快，分離的容量自然而然就要降低，獲得樣品的量很少，一般依次可以得到1mg樣品；製備色譜，製備富集是目的，要求高容量，分離度和速度自然就會降低，獲得樣品可以是分析色譜的幾倍、幾百倍以及上千倍，一般簡單一次得到的樣品量不少於100mg。

NO 3：分析色譜與製備色譜的區別點

4、分析色譜與製備色譜的關係如何？

分析色譜是製備色譜的基礎。當我們在分析色譜上取得了良好的分離效果時，可以將其放大，應用到製備色譜上。將分析色譜的進樣量增大，同時得出大量的所需物質（餾分）的過程就可以稱為製備色譜。分析色譜的目的，是分析出混合物中一個（或者幾個）純物質的含量。製備色譜的目的，是從混合物中得到純物質。為了加快分離的時間與提高分離的效率，製備色譜的的進樣品量很大，導致製備色譜柱子的分離負荷的相應加大，也就必須加大色譜柱填料，增大製備色譜的直徑和長度，使用的相對多的流動相。

5、製備色譜能當分析色譜用嗎？

製備色譜與分析色譜差別較大在於精度。製備色譜為了獲得分離物質的純度和量，適當的放棄了對於精度的苛求。製備色譜當做分析色譜用，應該針對具體的樣品情況而定。樣品較易分離時，製備色譜還是可以當分析色譜使用。

分析色譜：在乎分析結果,對化驗結果的純度,比例等要求準確，而對收率，濃度等產品參數不在乎，一次進料，而且每次進料少；製備色譜：比較在乎高效能得到純化物質。

色譜包含多種操作方式不同但原理相同的分離、分析技術。按其流動相和固定相狀態不同分為氣相色譜和液相色譜。今天，隨測了麼小編來看一下色譜儀具體是怎麼工作的吧！

氣相色譜儀流程

你一般看到的氣相色譜儀是長這樣的。

色譜儀

以氣相色譜儀為例，主要由三大部分構成：載氣、色譜柱、檢測器。每一模塊具體工作流程如下。

注射器

色譜柱

100%Dimethylpolysiloxane，100%聚二甲基矽氧烷

產品牌號：AC1，OV-101，OV-1，DB-1，SE-30，HP-1，RTX-1，BP-1

5%Phenyl dimethylpolysiloxane, 5%二苯基(95%)二甲基聚矽氧烷

產品牌號：AC5，SE-52，

5% Phenyl 1%vinyldimethyl polysiloxane，5%二苯基1%乙烯基(94%)二甲基聚矽氧烷

產品牌號：OV-5，DB-5，SE-54，HP-5，RTX-5，BP-5

50%Phenyl dimethylpolysiloxane, 50%二苯基(50%)二甲基聚矽氧烷

產品牌號：OV-17，HP-50，RTX-50

14%Cyanopropylphenyl polysiloxane, 14%氰丙基苯基(其中7%氰丙基7%苯基)(86%)二甲基聚矽氧烷

產品牌號：AC10，OV-1701，DB-1701，RTX-1701

50% Cyanopropylphenyl polysiloxane，50%氰丙基苯基(其中25%氰丙基25%苯基)(50%)二甲基聚矽氧烷

產品牌號：AC225，OV-225，BP-225，DB-225，HP-225，RTX-225

polyethylene glycol,聚乙二醇

產品牌號：AC20，PEG20M，HP-INNOWAX

氫焰檢測器

Size exclusion chromatography（SEC）

體積排阻色譜法（SEC）是利用多孔凝膠固定相的獨特特性，主要依據分子尺寸大小的差異來進行分離的方法，樣品分子與固定相之間不存在相互作用。

根據所用凝膠的性質，可以分為使用水溶液的凝膠過濾色譜法（GFC）和使用有機溶劑的凝膠滲透色譜法（GPC）。

只依據尺寸大小分離，大組分最先被洗提出

原理：色譜固定相是多孔性凝膠，只有直徑小於孔徑的組分可以進入凝膠孔道。大組分不能進入凝膠孔洞而被排阻，只能沿著凝膠粒子之間的空隙通過，因而最大的組分最先被洗提出來。

直徑小於孔徑的組分進入凝膠孔道

小組分可進入大部分凝膠孔洞，在色譜柱中滯留時間長，會更慢被洗提出來。溶劑分子因體積最小，可進入所有凝膠孔洞，因而是最後從色譜柱中洗提出。這也是與其他色譜法最大的不同。

依據尺寸差異，樣品組分分離

體積排阻色譜法適用於對未知樣品的探索分離。凝膠過濾色譜適於分析水溶液中的多肽、蛋白質、生物酶等生物分子；凝膠滲透色譜主要用於高聚物（如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯）的分子量測定。

Ion exchange Chromatography(IEC)

離子交換色譜是利用被分離組分與固定相之間發生離子交換的能力差異來實現組分分離。

離子交換色譜主要用於分離離子或可離解的化合物。

原理：固定相為離子交換樹脂，樹脂分子結構中存在許多可以電離的活性中心。流動相最常使用水緩衝溶液，也有有機溶劑如甲醇，或乙醇同水混合。

初始平衡狀態

流動相帶著樣品組分電離生成的離子通過固定相時，待分離組分中的離子與樹脂分子結構中可電離的活性中心發生離子交換，形成離子交換平衡，從而在流動相與固定相之間形成分配。

樣品組分與活性中心發生離子交換

固定相的固有離子與待分離組分中的離子之間相互爭奪固定相中的離子交換中心，並隨著流動相的運動而運動，最終實現分離。

洗提過程

洗提過程

Affinity Chromatography(AFC)

親和色譜法是利用與固定相不同程度的可逆結合的親和性，使成分與雜質分離的色譜法。固定相為相互間具有高度特異親和性的二種物質之一。

初始平衡狀態

親和吸附

不同分子與固定相間親和力大小有差異，選擇適當的洗脫條件便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。

解吸附

主要用於分離活體高分子物質、過濾性病毒及細胞。優點是操作簡便、效率高、條件溫和，缺點是使用局限性大。

Hydrophpbicinteraction Chromatography(HIC)

Hydrophilicinteraction chromatography (HILIC),similar to normal phase chromatography (NPC)

Reversed phasechromatography (RPC)

Mixed modechromatography

色譜儀的選用依據：

相對分子質量小於200、揮發性比較好的化合物，可用氣相色譜儀剖析。

相對分子質量在200～2000的化合物，可用液-液分配色譜儀、液-固吸附色譜儀和離子交換色譜儀剖析。

相對分子質量大於2000的化合物，可用凝膠色譜儀剖析。

水溶性樣品選用離子交換色譜儀和液-液分配色譜儀剖析。

微溶於水，但用酸或鹼能很好電離的化合物，可用離子交換色譜儀剖析。

油溶性和非極性的樣品，可選用液固吸附色譜儀。

含有離子型或可離子化的化合物，或者能與離子型化合物相互作用的化合物（如配位體和有機螯合劑），可首要考慮用離子交換色譜儀，或液-液分配色譜儀和凝膠色譜儀。

具有不同官能團的化合物、同系物，可用液-液分配色譜儀剖析。

異構體可用液固吸附色譜儀剖析。

高分子聚合物可用凝膠色譜儀。

高效液相色譜分析法和氣相色譜法的區別：

1、概念區分：

氣相色譜：氣相色譜是一種物理的分離方法。利用被測物質各組分在不同兩相間分配係數(溶解度)的微小差異，當兩相作相對運動時，這些物質在兩相間進行反覆多次的分配使原來只有微小的性質差異產生很大的效果而使不同組分得到分離。

液相色譜：高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上引用了氣相色譜的理論。在技術上，流動相改為高壓輸送；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜(每米塔板數可達幾萬或幾十萬)；同時，柱後連有高靈敏度的檢測器可對流出物進行連續檢測。

2、應用範圍區分：

氣相色譜：分離能力好、靈敏度高、分析速度快、操作方便等。

受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析，一般對500℃以下不易揮發或受熱易分解的物質部分可採用衍生化法或裂解法。

液相色譜：高效液相色譜法只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此，不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大(大於400以上)的有機物(些物質幾乎佔有機物總數的75%~80%)原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中能用氣相色譜分析的約佔20%而能用液相色譜分析的約佔70~80%。

3、儀器構造區分

1、氣相色譜：

由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均在控制狀態。

1.柱箱:

色譜柱是氣相色譜儀的心臟，樣品中的各個組份在色譜柱中經過反覆多次分配後得到分離從而達到分析的目的，柱箱的作用就是安裝色譜柱。由於色譜柱的兩端分別連接進樣器和檢測器，因此，進樣器和檢測器的下端(接頭)均插入柱箱。柱箱能夠安裝各種填充柱和毛細管柱，並且操作方便。色譜柱(樣品)需要在一定的溫度條件下工作，因此，採用微機對柱箱進行溫度控制。並且由於設計合理，柱箱內的梯度很小。

對於一些成份複雜、沸程較寬的樣品，柱箱還可進行三階程序升溫控制。且程序設定後自動運行無需人工幹預，降溫時還能自動後開門排熱。

2.進樣器:

進樣器的作用是將樣品送入色譜柱。如果是液體樣品，進樣器還必須將其汽化。因此，採用微機對進樣器進行溫度控制。

根據不同種類的色譜柱及不同的進樣方式，共有五種進樣器可供選擇:

填充柱進樣器

毛細管不分流進樣器附件；

毛細管分流進樣器附件；

毛細管分流/不分流進樣器；

六通閥氣體進樣器；

3.檢測器:

檢測器的作用是將樣品的化學信號轉化為物理信號(電信號)。

檢測器也需要在一定的溫度條件下才能正常工作，因此，採用微機對檢測器進行溫度控制。

根據各種樣品的化學物理特性，共有五種檢測器可供選擇:

氫火焰離子化檢測器(FID)

熱導檢測器(TCD)

電子捕獲檢測器(ECD)

氮磷檢測器(NPD)

火焰光度檢測器(FPD)

4.數據處理系統：

該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、製備或鑑定工作能正確開展。

 

2、液相色譜

高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。

1.進樣系統

一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作進樣量是恆定的。

這對提高分析樣品的重複性是有益的。

2.輸液系統

該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4X107Pa流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值或改用

3.分離系統

該系統包括：色譜柱、連接管和恆溫器等。

色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管)內徑為2~5mm，由優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，柱內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成)，固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成，它們都有惰性(如，矽膠表面的矽酸基因基本已除去)、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬(與氣相色譜中固定相的製備一樣)或者用化學法偶聯各種基因(如，磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。

因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性，例如，在多孔性矽膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。

另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小、微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。

這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60℃通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。

4.檢測系統

高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和螢光檢測器三種：

(1)、紫外檢測器

該檢測器適用於對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。

其特點:使用面廣(如，蛋白質、核酸、胺基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用)；靈敏度高(檢測下限為10-10g/mL)；線性範圍寬;對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

(2)、示差折光檢測器

凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。糖類化合物的檢測使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低(檢測下限為10-7g/mL)流動相的變化會引起折光率的變化。因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。

(3)、螢光檢測器

凡具有螢光的物質，在一定條件下，其發射光的螢光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有螢光的有機化合物(如，多環芳烴、胺基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等)的測定，其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14g/mL）痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。

5.數據處理系統

該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、製備或鑑定工作能正確開展。

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