如此多的變量影響多重PCR的效率和特異性,導致其不能很好地運行

2020-12-04 小侃姐姐

優先擴增同樣可以由靶序列本身具有的差異造成。例如，靶內富含GC區的位置，以及靶序列和模板DNA的其他區域形成二級結構或瞬態雙鏈的傾向。這些問題可以通過仔細選擇靶序列以及使用降落PCR (見方案3)得到緩和。

如此多的變量影響多重PCR的效率和特異性，導致其不能通過現成方案很好地運行。成功的關鍵是反應中每個步驟、每種成分的系統優化(圖1)。這是一個相當大量的工作，除非多重PCR方案多次被使用，將不會符合成本效益的。

1997年，Henegariu等發表了一個有用的逐步流程圖說明如何避免、判斷及解決多重PCR中常出現的問題。圖1是一個修改和升級版的流程圖。Markoulatis 等(2002) 的文章也是建立，以及優化多重PCR的有用的參考資源(同樣，見第9章中有關多重PCR的模塊信息)。

標準PCR很容易擴增出長度小於3000p的DNA片段，該長度能滿足大部分的用途，但是不足以去擴增整個哺乳動物基因甚至是平均長度的cDNA。 與全長產物不同，較長模板的標準PCR擴增會產生不同長度的片段，從而在凝膠上呈現不同的條帶。而關於普通PCR擴增長模板失敗的解釋有:

●當緩衝液暴露在高溫下，不能維持其pH的穩定從而損壞模板和產物DNA

●一些散在二價陽離子(最首要的當屬Mn2+)在高溫時會促進DNA鏈的裂開

●在PCR循環的加熱階段，長DNA分子變性存在困難

●耐熱聚合酶如Taq由於缺乏剪輯功能，從而導致高概率地摻入錯誤鹼基(在延伸鏈3'端摻入錯誤鹼基會造成酶的停頓，從而會限制PCR產物的大小)

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