應用專題|乾燥失重法檢測食品中微生物(單細胞酵母)的生長

本項研究提供了一種基於乾燥失重法的生物活性測試方法，為食品行業擴展了微生物檢測範圍的全新視角。

第一  背景

20世紀以來，農業生產變得更加工業化和機械化，食品的保存和防腐是長距離運輸過程中最重要的工作。罐裝、巴氏殺菌和真空密封等方法常被用來延長食品在運輸過程中的保質期。但是實踐證明，這些方法是不完善的。在過去的一個多世紀裡，許多消費者都曾患過因食物變質而引發的疾病。食源性疾病是由微生物汙染引起的，汙染源包括大量的寄生蟲、真菌、細菌甚至病毒。當任意一種微生物汙染源被人類誤食後，他們將在人體內迅速複製和繁殖，並引發疾病，嚴重的情況下甚至會導致死亡。

今天，我們有更嚴格的政府監督和持續的微生物檢測，以確保我們70億消費者的食品安全。這些測試方法包括：選擇性培養、各種微觀測試或光譜學測試、酶聯分析和上市前的基因篩查等。然而，儘管我們有如此多的檢測方法，食源性疾病仍然是一道公共衛生風險。關於雞肉、生菠菜、寵物食品等食品的細菌汙染和產品召回報告仍然能在我們的集體意識中引起共鳴，並促使食品工業和政府機構尋求更好的方法來檢測和預防微生物汙染。

除了病毒以外，大多數食源性微生物都有一個共同的生命進程：進食，生長或複製，產生廢物。事實上，呼吸對於生物完成這一生命進程是必不可少的，儘管有一些微生物在缺氧（厭氧呼吸或發酵）的情況下也能完成。有氧呼吸描述的是在有氧條件下從複雜的有機分子（如糖、脂肪或蛋白質）中釋放能量的過程。在這一過程中，二氧化碳和水蒸氣作為副產物被釋放出來，有機體會損失質量（或重量）。質量的損失不僅來源於水分的釋放，更重要的是碳由固態轉變為氣態的二氧化碳所帶來的損失。

根據所有生命體在呼吸過程中都會經歷質量損失的特性，理論上可以使用質量損失的方法測量生物活性。由於大多數人類病原體的最佳生長溫度為37℃（人體溫度），因此可以在此溫度下培養受汙染的食品樣品，並測量質量損失率。我們可以使用標準培養方法來實現這一點，定期對樣品進行稱重，以跟蹤質量損失率，並與對照樣品（同樣的樣品，但沒有汙染）進行對比分析。為了驗證這一假設，我們使用乾燥失重水分分析儀（Computrac MAX 4000XL）和附加的溼度空氣泵進行模擬測試。溼度空氣泵可以使樣品處於受控的溼度範圍；MAX 4000XL能夠保持樣品的溫度，在較長的時間內提供準確的重量損失讀數，並且還可以測量氣體流量（溼度空氣）。大多數食源性病原體由細菌（如大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、肉毒梭菌等）組成，我們在此次AZI實驗室選擇了一種常見的麵包酵母，釀酒酵母作為研究對象。這種酵母是一種生長速率相對較快的單細胞酵母（繁殖時間為90min），通常作為麵包和糕點的發酵劑。它在性質上是無害的，不是人類病原體，但與某些致病酵母（如白色念珠菌）具有相似的生理學特性。

在本研究中，我們首先使用離體測試方法，通過測量接種酵母的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的失重數據來驗證該方法的可行性，然後使用類似的方法對真實的食品進行分析測試。

實驗室粘度計

該項研究提供了一種基於乾燥失重法的生物活性測試方法，為食品行業擴展了微生物檢測範圍的全新視角。這種方法並非要取代任何一種傳統的檢測方法，而是希望在食品安全的質量檢驗過程中增加一種新的檢測方法。由於本研究中專門研究了釀酒酵母的發酵特性，因此這種方法在確定某些酵母在麵包或釀酒行業的可行性方面特別有用。傳統的光譜法只能通過光密度表徵酵母的種群密度，不能進一步說明他們的碳排放能力。

第二  原料準備——培養基製備和酵母培養

• 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基

• 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）是一種半固體培養基，通常用於實驗室真菌培養。瓊脂是一種海藻提取物，具有與凝膠相似的硬度，由纖維素取代蛋白質組成（明膠）。由於瓊脂不含蛋白質，因此可以在121℃下進行消毒，並且仍然保持凝結性能，而不像明膠在這個溫度下會變性。需要重點注意的是，當微生物在瓊脂上生長時，瓊脂本身不會被消耗掉，它只是一個支架，用來保留與之混合的液體營養液（本研究中指的是PDB）。

• 馬鈴薯葡萄糖培養液

• 馬鈴薯葡萄糖培養液是將去皮的馬鈴薯燉煮，並以正確的比例添加葡萄糖，製備的一種可以被真菌使用的營養液。單細胞酵母可以在這種液體培養基中以點細胞懸浮液生長，這種培養方式被稱為液體培養。

• 澆注瓊脂板

• 在本實驗中，我們選用直徑為5英寸的平底樣品盤作為培養皿（或聚苯乙烯培養皿），在121℃下消毒30min後待用。從烘箱中取出熔化的PDA混合物，將其放置在500ml的錐形燒瓶中冷卻至約50℃，燒瓶瓶口輕微打開。在無菌工作檯內，移取30ml冷卻的PDA培養基，倒入無菌的空白培養皿中，然後用熱消毒鍋的鋁製樣品盤（4000 XL樣品盤）覆蓋每個培養皿，以防止汙染。待PDA凝固後，使用密封條將蓋子和培養皿密封，防止水分過度流失，並將其存放在4℃的冰箱中。

• 釀酒酵母液體培養

• 移取部分PDB用於培養釀酒酵母（7g/包）。將100ml PDB和約3.5克凍乾酵母添加到經熱滅菌的500ml燒杯中，並在無菌條件下攪拌混勻。在2小時內，每隔30min周期性地攪拌混合液，然後將其存儲在4℃冰箱中，以備後續使用。

• PDA培養基上接種釀酒酵

• 液體培養基中的酵母經過大量繁殖，即可接種至PDA培養基上。將一個經火焰灼燒消毒的接種環浸入至液體培養基中，以粘附酵母細胞，然後均勻地塗布，是酵母分散在培養基表面。每個培養皿塗布三次，以提供足夠數量的酵母初始種群。將所有接種過的培養皿倒置，以防止蓋子上的冷凝水滴落至平板上並幹擾細胞生長，具體操作方法如下圖所示：

在線粘度計

第三  機型選擇

本文採用的儀器（下圖）是美國AMETEK Brookfield公司——MAX 4000XL乾燥失重分析儀。

第四  實驗方法

• 測試程序

• 為了實時跟蹤重量損失情況，我們需要將測試時長為2小時的單個測試程序串聯12次，以提供準確並持續的24小時內重量損失的數據。使用儀器的「WebServer」功能，將儀器與實驗室區域網聯通，可以幫助測試人員以EXCEL格式將原始數據導出並進行分析。若儀器啟用「Web Server」功能，當關機後重新開啟儀器時，需要重新連接區域網並建立新的IP位址。通過「菜單」→「設置菜單」→「乙太網設置」即可查看儀器的IP位址。

• 釀酒酵母並不是真正的人類病原體，37℃對酵母的最佳生長條件來說溫度太高，因此我們將溫度下調至30℃。需要主要的是，儀器屏幕上能夠顯示穩定的溫度讀數，但是在使用前需要通過外接熱電偶溫度探針進行校驗，以確保溫度的準確性。MAX 4000XL在實驗過程中的作用類似於一個培養箱：為酵母生長提供最佳溫度條件，同時在一定時間內實時測量重量損失的情況。每個單獨的2小時的測試程序設置參數如下：

• 樣品量：25.0±15.0g

• 閒置溫度：30℃

• 測試溫度：30℃

• 樣品盤稱重：標準

• 樣品稱重：標準

• 結束條件：Time，120min（最長測試時間）

• 串聯測試：Yes

• 由於每個測試程序的輸出結果默認為「水分百分含量」，因此我們創建了一個自定義公式來定義總重量損失百分比。前兩個小時的測試程序不需要這個公式，但是接下來的測試程序則需要用到這個公式，以實時準確的提供重量損失數據。

• 自定義公式：[ (WI1-WF)/WI1] *100

• WI1：第一次測試時樣品的初始重量；

• WF：當前測試程序結束時樣品重量。

• 空氣發生器：提供潮溼的空氣

• 大多數食品中都含有大量的水分，根據樣品大小、水分分布情況、樣品表面狀況以及所處環境不同，具有各自獨特的蒸發曲線。為了最大限度地減少瓊脂培養基和麵包片的水分蒸發，我們將空氣發生器（DAG）改造成加溼器，如下圖所示。DAG產生的氣流經導管進入500ml密閉錐形瓶中，在蒸餾水中鼓泡，形成潮溼氣流，然後經過管路進入MAX 4000XL的測量室。未連接DAG時，儀器測量室的RH讀數為10.6%，連接DAG，潮溼氣流進入儀器測量室30min後，RH讀數增加至26.5-30.1%，此時測試溫度為30℃。

• 最初，MAX 4000XL設計的氮氣吹掃功能，可以使高揮發性和潛在爆炸性的樣品在無氧室內進行測試（防止燃燒或爆炸）。對於這個實驗，儀器的這個功能可以為樣品和在其上生長的酵母提供半潮溼的環境。

• MAX 4000XL測試

• 當選擇12個串聯測試中第一個測試程序且溫度達到30℃時，所有的測試程序就緒並依次運行。點擊開始，儀器依次提示稱量樣品盤，在規定的稱樣範圍內稱量樣品（10-40g）。對於PDA樣品（對照樣品和接種樣品），測試時應去除培養皿上的蓋子，然後將其向上放置在儀器的樣品盤上面，儀器會識別重量的變化以及是否在可接受範圍內。然後提示關閉保護蓋，此時測試程序開始運行並持續24小時。

• 數據分析

• MAX 4000XL會自動存儲測試數據，也可以通過Web Sever功能將原始數據以EXCEL格式導出。必須通過剪切和粘貼的方式將原始數據轉移至新的表格中並重新排序，因為導出的報告的數據順序與測試順序相反。建立測試方法時自定義的公式只能在儀器屏幕上顯示，數據導出後必須在EXCEL表格中重新建立公式進行重量損失百分比的計算。公式如下：

• MAX 4000XL每30秒讀取一次樣品重量和損失速率。但是，當一個新的測試開始時，儀器不能立即識別到這是一個連結測試，此時重量損失百分比和速率都會下降至零點。如果將前30秒的數據保留在結果序列中，則在生產的圖表中每隔2小時每個測試程序開始時會出現數據急劇下降，並影響平均值的計算，因此可以將這段數據忽略掉。

• EXCEL表格中生產圖

• 在EXCEL表格中使用標準散點圖創建本文結果部分所示的圖表，縱坐標為3次重複試驗的「總重量損失百分比」平均值，橫坐標為測試時間（單位為小時）。實驗過程中的4個變量分別為：

• 1）PDA（未接種）——對照樣品

• 2）PDA（接種酵母的實驗樣品）

• 3）添加了5滴無菌PDB液體培養基的麵包片——對照樣品

• 4）添加了5滴酵母懸浮液的麵包片

• 每個圖表中顯示的誤差線對應的是每個變量3次重複試驗過程中每2小時間隔所取數據的標準偏差。

結果與分析

1. PDA（未接種）——對照樣品重量損失

本研究的第一個難點是，必須用數據驗證通過重量損失來衡量生物活性的理論的可行性。從一開始我們就知道，將任何樣品放置在MAX 4000XL的測量室內，僅靠水分蒸發就會導致重量損失。因此，我們需要得到一個富含營養的PDA培養基的基準蒸發曲線。下圖所示的藍色曲線即為未接種酵母的PDA培養基的重量損失曲線，測試數據來源於三次獨立的重複實驗。

確定了基準蒸發曲線（更準確地說是總失重百分比曲線）後，我們就可以預測，如果一個生命有機體（釀酒酵母）開始在培養基中消耗葡萄糖，便會產生二氧化碳和水分，瓊脂培養基會比對照組的樣品以更快的速率損失重量。儘管我們不能完全證明二氧化碳和水分是造成重量損失的元兇，但我們仍然可以觀察到，測試時間達到8小時後，實驗組樣品的重量損失比例比對照組更高。隨著時間的延長，實驗組的重量損失百分比更高。24小時的測試程序結束後，對照組樣品的重量減少約6.88%；而接種酵母的實驗組樣品的測試數據為11.21%，差距為4.33%。兩組實驗均獨立重複測試3次，數據記錄間隔為2小時。

2. 麵包片重量損失

當確認理想條件下重量損失可以衡量生物活性之後，我們將注意力轉向一種簡單但實用的食品：麵包。麵包製作過程中會使用酵母發酵，本身含有酵母容易吸收和利用的營養物質。

如前所述，每種食物類型都有不同的水分釋放特性，因為我們必須首先確定麵包的基準水分釋放曲線，然後與因生物活性而導致的重量損失進行比較。由於麵包的含水量高，且比瓊脂板表面積大，實驗證明麵包的水分蒸發率比瓊脂板大得多，但是最終會到達一個平臺期。

在PDA的實驗中，接種酵母培養液不會帶來大量的水分。但是，在麵包片實驗中，考慮到麵包表面粗糙性，無法使用接種環進行塗布接種。為了在麵包上添加更多的酵母，我們直接在麵包片上滴加5滴含有酵母的PDB液體培養液（保證酵母開始生長時有足夠的水分）。這5滴培養液給麵包片帶來了大量的水分，因此，我們在對照組樣品上也滴加了5滴無菌液體培養液（不含酵母）。在24小時的培養時間內，對照組的重量損失率為26.76%；實驗組的重量損失為28.39%，二者相差1.63%。

與PDA實驗相比，實驗組和對照組的差異更小，但考慮到僅僅水分蒸發就損失了非常多的質量，在培養至第14小時後，我們能夠觀察到兩組樣品存在統計學上的差異。麵包片的測試方法與PDA測試方法完全相同。

結論

基於孵育的食品微生物汙染檢測並不是食品安全篩選的新技術。事實上，選擇性培養和光譜學方法往往依賴於增加潛在汙染形式的物理數量，以便光譜學方法可見的感知或檢測範圍。重量損失法作為一種新的方法可以指示食品中微生物的存在，但是首先要了解每種產品的水分釋放基準曲線。使用這種方法，實驗人員無需使用昂貴的選擇性介質或專門的光密度容器，將食品直接放置在MAX 4000XL的測量室內，無需任何加工或培養技術。此外，用戶還可以實時查看水分釋放速率（或重量損失速率）。值得注意的是，我們根據釀酒酵母的繁殖特點（倍增周期為90min），選擇了24小時的培養周期（溫度為30℃）。如前所述，釀酒酵母不是一種人類病原體，其性質類似於細菌。大腸桿菌是一種常見的食源性細菌，在理想條件下（37℃），大腸桿菌的倍增周期僅為20min。如懷疑受該細菌感染，分析人員可以選擇一個相對較短的培養時間，但是通過一些前期工作來確定合適的培養時間。

儘管DAG被改造成加溼器使用，但仍需進一步的研究以確定該裝置能否對生長中的生物體施加足夠的水分，但是該裝置可以作為預防措施，以防止在測試過程中過度乾燥。同時，我們也可以使用該裝置填充生長腔提供其他氣體。在本研究中，我們使用的是潮溼的空氣。另外，我們也通過施加潮溼氮氣來觀察厭氧條件下重量損失的情況。經過數次試驗，我們發現：厭氧條件下，接種酵母的PDA培養基的重量變化與有氧條件下未表現統計學差異。這可能與我們選擇的酵母菌株有關，其在有氧和厭氧條件下均表現良好的適應性。有趣的是，在厭氧試驗結束後，分析人員聞到了輕微的酒精氣味。雖然純屬猜測，但可能表明酵母在這一過程中經歷了發酵，釋放了二氧化碳和酒精（而非水分）。

本研究的數據對烘焙和釀造行業具有特殊的指導作用。除了細胞計數以外，也可以通過其他方法來測試酵母種群的生存能力，因為種群的數量或密度不一定表示培養物的生存能力強大。根據不同產品的重量損失百分比來確定酵母菌株的生長速率，可能有助於麵包師或釀酒師對其產品最佳菌株的選擇。

也許MAX 4000XL的單培養腔可能存在一定的缺點，但是從微生物生長過程中收集的數據來看，我們能很好地了解其與食品間的相互作用。另外，一個穩定且受控的實驗環境意味著測試開始後，無需打開蓋子，這樣就可以有效防止溫度和溼度的波動。我們甚至可以在測試結束後連結一個滅菌程序。MAX 4000XL可以設置高達275℃的測試溫度，但滅菌程序的溫度設置為121℃就足以對大多數的食品進行消毒。總的來說，Computrac MAX 4000XL用於檢測微生物基於呼吸作用的生長情況是非常實用的，為分析人員提供了一種檢測食品中潛在汙染物的新的分析方法，幫助我們更好地了解固體和半固體食品中微生物生長和繁殖的實時情況。

MAX 4000XL 小百科