RNA幹擾這項技術在早期臨床前研究過程十分複雜，南非研究人員發現，合成siRNA的設計使得其結構特徵與早期研究中確定的結構特徵並沒有明顯偏差。並且總是由19-21個核苷酸雙鏈組成，在3′端有兩個核苷酸懸置。本研究已發表科學雜誌《Viruses》。
B肝RNAi小鼠實驗，南非科學家發現，AAV抑制長達40周
南非研究人員介紹，在隨後RNAi這項技術探索了化學修飾，作為提高siRNA療效的一種手段。最初的報告探討了′-OH修飾（2′-氟和2′-O-甲基）、脫氧核糖核酸的包合和硫代磷酸酯鍵的使用。這些修飾組合，被引入到siRNA的兩條鏈中，並在體外和小鼠中進行評估。修飾可使siRNA的體外穩定性從幾分鐘提高到數小時，並且沉默效果不受影響。
在體內，修飾siRNAs的表現優於未修飾的siRNA。將修飾後的siRNA構建成脂複合物，然後將其輸送到穩定表達B肝病毒的轉基因小鼠中，高效地抑制病毒複製。此外，最初每日以3天劑量的脂符合siRNA，隨後是單周劑量，沉默可以維持長達6周。最近，還研究了含有新修飾核糖核苷酸的合成siRNA的活性。
在合成的抗B肝病毒siRNA中，加入阿爾替醇（一種取代核糖的六元環）可提高沉默活性，但在體內會產生一定的肝毒性。相反，與未修飾的siRNA相比，altritol修飾的siRNA表現出更好的免疫刺激特性。2′-O-胍丙基修飾的核糖核苷酸的摻入同樣顯示了穩定性、沉默和免疫刺激特性的改善。siRNA的易製造性和與非病毒載體的相容性，刺激了它們在治療上的迅速採用和應用。這突出的事實是，已經有幾個臨床試驗正在評估抗B肝病毒siRNAs的療效。
南非約翰尼斯堡威特沃特斯蘭德大學健康科學學院病理學院抗病毒基因治療研究室詳細解釋，儘管化學修飾siRNAs，可以延長其半衰期以延長治療沉默，但要有效治療慢性B肝病毒感染，需要反覆給藥。從DNA盒中，再生表達RNAi激活劑，具有更持久的沉默潛力。RNA聚合酶III驅動的轉錄，自然產生短的RNA序列，最初被用於RNAi激活劑的表達。
從RNA聚合酶III啟動子轉錄shRNA序列，首先由Brummelkamp等人描述。使用H1啟動子，被證明是非常流行的，並且仍然是基因沉默的重要方法。在shru6細胞中，用該啟動子表達HBV-53具有良好的抗病毒效果。強烈的shRNA表達的一個警告是，內源性miRNA處理可能被破壞，從而導致小鼠嚴重毒性。H1啟動子和tRNALys啟動子的抗HBV shRNA的表達，也有效地抑制了B肝病毒複製。
miRNA作用機制的特性研究，旨在探索更接近這些天然基因消音器的RNAi激活劑。利用已知的miRNA序列和結構作為支架，研究人員已經開發出類似於pre-miRNAs和pri-miRNAs的人工miRNA。特別是，人工pri-miRNAs（apri-miRNAs）非常有用，因為它們允許RNA聚合酶II啟動子的表達，從而能夠更好地控制RNAi激活劑，並避免過度表達引起的毒性。
此外，由於pri-miRNAs通常以多順反子序列的形式存在，因此這一特性可能適用於從單個DNA盒中產生多靶向miRNA。這對於限制B肝病毒逃逸突變體的出現，特別有用。表達盒的另一個優點是與高效的病毒載體相容。通過將抗HBV shRNA表達盒整合到可有效抑制轉基因小鼠中HBV複製的嗜肝腺病毒載體中，證實了這一點。
總體上，這種方法被擴展到使用慢病毒和腺相關病毒載體（AAVs），來傳遞HBV靶向多順反子apri-miRNA。使用AAV，在轉基因小鼠中，B肝病毒複製的抑制作用可長達40周。考慮到長期沉默治療慢性B肝病毒感染的重要性，這是一個重要的發現（2020年8月4日 Viruses 南非約翰尼斯堡威特沃特斯蘭德大學健康科學學院病理學院抗病毒基因治療研究室）。