前言
測量不確定度從詞義上理解，意味著對測量結果可信性、有效性的懷疑程度或不肯定程度，是定量說明測量結果的質量的一個參數。實際上由於測量不完善和人們的認識不足，所得的被測量值具有分散性，即每次測得的結果不是同一值，而是以一定的概率分散在某個區域內的許多個值。
雖然客觀存在的系統誤差是一個不變值，但由於我們不能完全認知或掌握，只能認為它是以某種概率分布存在於某個區域內，而這種概率分布本身也具有分散性。測量不確定度就是說明被測量之值分散性的參數，它不說明測量結果是否接近真值。
2002年版中國藥典已經將《藥品檢測結果不確定度評定指導原則》收錄，目前正在社會徵求意見。未來是否強制執行也不得而知，不過在日常測量中考慮測量不確定度是一個大趨勢，特別是作為色譜人一定要站得更高一些，看的更遠一些！
色譜實驗中測量不確定度來源的識別應從分析測量過程入手，從影響測量結果的因素考慮，即對測量方法、測量系統和測量程序作詳細研究，為此應儘可能畫出測量系統原理或測量方法的方框圖和測量流程圖。測量結果不確定度的一般來源有：隨機性不確定度和模糊性不確定度。
隨機性的不確定度可以用測量列結果（觀測值）的統計分布來進行估算，並且以實驗標準偏差表徵，主要是條件不充分導致的。主要分為隨機性導致的不確定度和系統導致的不確定度。下表是色譜實驗中隨機性不確定度的舉例。
模糊性的不確定度可以用其它方法（根據經驗或其它信息的假定概率分布）來進行估算，並且也以標準偏差表徵。主要是物本身概念不明確導致的。下表是色譜實驗中模糊性不確定度的舉例。
2、色譜實驗中測量數學模型建立
應規定被測量，如：含量、有關物質含量等，明確被測量與其所依賴的輸入量的關係，還應包括對已知系統影響量的修正，建立數學模型。
Y = f (X1，X2，…，Xn)
Y為被測量（輸出量）；
X為影響量（輸入量）。
建立模型時，有一些潛在的不確定度來源不能明顯地呈現在上述函數關係中，它們對測量結果本身有影響，但由於缺乏必要的信息，無法寫出它們與被測量的函數關係。因此，在具體測量時無法定量地計算出它對測量結果影響的大小，在計算公式中只能將其忽略，而在模型中應包括這些來源。不過對於色譜實驗中的數學模型大多數都可用計算公式代表。
3、色譜實驗中測量標準不確定度評估
標準不確定度是用一倍標準偏差表示的測量不確定度。標準不確定度u(xi)與測量結果xi的比值為相對標準不確定度，計算合成標準不確定度時，一般以相對標準不確定度代入計算公式，可以達到量綱的統一。包括A 類評定和B 類評定。
（1）A類評定
通過對規定測量條件下獲得的測得量值的統計分析評定測量不確定度分量。採取逐項計算標準不確定度。
在重複性條件或重現性條件下對同一被測量X獨立重複測量n次，得到n個測量值xi(i=1,2,3…n)組成一個測量列,被測量X的最佳估計值是n個獨立測量值算數平均值，單個測量列的標準偏差為：
上式中n-1是自由度，標準偏差表徵了被測量X的分散性。測量列的標準偏差隨著測量次數的增加而趨於一個穩定的數值。
單個測量列平均值標準偏差就是測量X的A類標準不確定度。即：
測量列的平均值標準偏差則將隨著測量次數的增加而減少。
如果存在m個這樣的測量列，單個測量列的合併樣品標準偏差Sp為：
上式中Si是單個測量列的標準偏差，如果Si的自由度是υ0，則單個測量列的合併樣品標準偏差為mυ0。
（2）A類評定流程
（3）B類評定
B類評定係指被測量X的估計值xi不像A類那樣是由重複測得，其標準不確定度可用xi的可能變化的相關信息或資料來進行的一類評估。比如：權威機構發布的量值、有證標準物質的量值、校準證書、儀器的漂移、經檢定的儀器的準確度等級、根據人員經驗推斷的極限值等。
B類評定的方法是根據有關的信息或經驗，判斷被測量的可能值區間[-a,+a]，假設被測量值的概率分布，根據概率分布和要求的包含概率p估計因子k，則B類標準不確定度uB可由公式得到：
uB=a/k
式中：a為被測量可能值區間的半寬度。當k為擴展不確定度的倍乘因子時（擴展不確定度是標準差的倍數）稱包含因子（如果xi來源於說明書、校準證書、手冊或其他資料），其他情況下根據概率論獲得的k稱置信因子。B類評定常用到正態分布、均勻分布和三角分布。對應k值見下表：
很容易看出，對於已經給出置信水平的，可以參照上表查出對應的k值，代入公式可以計算標準不確定度。對於未給出置信水平可採用假設矩形分布或三角分布進行計算。
（4）B類評定流程
4、合成標準不確定度
被測量Y的估計值y=f(x1,x2,…,xN)的標準不確定度是由相應輸入量 x1,x2,…,xN的標準不確定度合理合成求得的，其表示式的符號為uc(y)。合成標準不確定度uc(y)表徵合理賦予被測量之值Y的分散性，是一個估計標準偏差。如果各輸入量是獨立無關的，則合成標準不確定度為
事實上，在色譜實驗室中為了簡化測量不確定度，我們應儘量使得各輸入量不相關。
5、擴展不確定度
擴展不確定度是被測量可能值包含區間的半寬度。根據輸出量的分布情況，求出所要求的置信概率水平p下的包含因子k ，則U=kuc(y)。
如果Y 接近於正態分布，則多數情況取p=95%，若不能判斷Y的分布，則取k=2或者3。
6、報告測量不確定度
報告測量不確定度應使用擴展不確定度U，同時給出特定的置信水平或包含因子。報告應儘可能詳細，以便使用者可以正確地利用測量結果，通常不確定度的有效數字不要多於兩位，末位後面如有數字需進位。
7、測量不確定度的評定流程
看了上述的理論知識，估計大部分讀者已經思路混亂，不知所云。下面筆者將採用色譜實驗室中分析的例子簡單說明，希望可以幫助廣大讀者擴展思路。
HPLC法測定某原料藥中主成分含量的不確定度評定
（1）測量方法
精密量取本品適量，加稀釋劑成每1ml中含100μg的溶液，取10μl注入液相色譜儀，另取對照品適量，同法製備並測定，按外標法計以峰面積計算主成分含量。
（2）數學模型
式中X為某原料藥的百分含量；WR為對照品稱樣量；PR為對照品溶液中主成分的峰面積；PS為樣品中主成分的峰面積；WS為樣品稱樣量；VS為樣品稀釋倍數；VR為對照品稀釋倍數；p為對照品的純度（標識量，無需考慮不確定度）；
（3）不確定度來源
採用魚骨法進行羅列不確定度來源
（4）不確定度量化
對照品的峰面積的測量不確定度主要來源於：
一是進樣重複性，由前述知識可知，重複性屬於A類不確定度。對照品溶液進行測定時，在進樣、分離、檢測過程中，產生的隨機影響包括進樣體積重複性、泵流速穩定性、分離重複性、檢測器穩定、積分變動性等。
二是系統影響，比如泵、色譜柱、檢測器等，由於對照品溶液與樣品溶液在同等條件下進行，故該項標準不確定度互相抵消。則對照品峰面積的測量不確定度來源於進樣重複性。
故u(PR)=對照品溶液中主成分6個峰面積的標準偏差（比如為4372）。同樣，樣品溶液峰面積重複性的測量不確定度u(PS)= 樣品溶液中主成分6個峰面積的標準偏差(比如4303)。
對照品稀釋倍數的測量不確定度主要來源於：
一是容量瓶校準，屬於B類不確定度。10ml的容量瓶的容量允差為±0.01ml，按矩形分布，標準偏差為：
二是容量瓶定容時的變動性，屬於A類不確定度，將同一個10ml的容量瓶用水定容10次並稱重，得出標準偏差為0.00040。
三是溫度，液體膨脹係數，不過對照品溶液和樣品溶液是在同一溫度下製備，故膨脹係數引起的測量不確定度是可以忽略的。則對照品溶液稀釋倍數VR的標準偏差：
同樣，樣品溶液的係數倍數VS的標準偏差為0.0058。
對照品稱樣量的測量不確定度主要來源於：
一是天平校準，屬於B類測量不確定度。比如天平的最大允差為±0.03mg，按正態分布計算標準偏差為0.03/1.96=0.0153。此外還有天平靈敏度，不過由於對照品和樣品的稱樣均在同一天平上，故天平稱量範圍內的系統漂移將被抵消，此項影響不計。
二是稱量的重複性，屬於A類不確定度。可根據天平說明書直接讀取對應稱樣量重複性的標準偏差（比如0.02）。則對照品稱樣量WR的標準偏差：
同樣，樣品稱樣量WR的標準偏差為0.0252。
（5）計算合成測量不確定度
各來源測量不確定度總結如下：
某原料藥中主成分百分含量
則合成不確定度為：
（6）計算擴展不確定度
測量結果符合正態分布，取置信概率為95%，選擇包含因子k=2，U=2×93%=1.86%
（7）測量不確定度報告
HPLC法測定某原料藥中主成分含量為X=（96.84±1.86）%，k=2。
結 語
色譜實驗中測量不確定度的評定是一個及其繁瑣和複雜的過程，在評定中應該最大程度上將測量不確定的來源考慮全面。測量不確定度評定能幫助我們找出測量結果超限的真正原因，規範測量過程中操作。
此外筆者認為，在藥物研究中會逐漸強制要求對測量不確定度進行評定。因此，色譜實驗中應該具有測量不確定度評定的意識。
另外測量不確定度與設備管理具有緊密聯繫，掌握好測量不確定度能夠對設備進行最優選擇，節約實驗室採購成本。有興趣者可與筆者單獨聯繫。
以上是筆者對色譜實驗中測量不確定度理論的簡淺總結，難免不妥，還望批評指正!
參考文獻
【1】CNAS-CL07:2011《測量不確定度的要求》
【2】CNAS-GL05:2011《測量不確定度的實施指南》
【3】CNAS-GL06:2011《分析化學中不確定度的評估指南》
【4】陳瑋,蘇克劍, 孫黎.HPLC法測定阿莫西林含量的測量不確定度評估[J]. 中國藥房,2011(20):1910-1912.
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