一種基於小分子染料的蛋白質標識技術以及在藥物研發中的應用

來源:中國科協創新戰略研究院《創新研究報告》

第71期（總第403期）2020-10-15

編者按：蛋白質間相互作用是許多生物過程的核心，因此被作為潛在的藥物靶點，但是如何去識別蛋白間接觸界面仍具挑戰。來自喬治·梅森大學（George Mason University）的研究人員在《The Journal of Biological Chemistry》雜誌上報導了一種優化的基於小分子染料的蛋白質標識技術，該技術可以準確識別蛋白質複合體結合界面上的關鍵位點和界面拓撲結構，有助於定位藥物靶點，可用於小分子或肽基靶向抗腫瘤藥物的研發。此外，由於不需要獲取蛋白質的晶體結構信息，對於不適用晶體結構表徵技術的蛋白質，例如結合界面複雜的PD1/PD-L1 複合體和晶體結構不穩定的 YAP2/ZO-1 複合體，該技術也可以適用。

一、研究意義

蛋白質複合體（Protein complex）是有兩個以上功能相關、形狀互補的多肽鏈或蛋白質通過非共價鍵結合形成的複合物，蛋白質複合體在信號通路①的傳導過程中起到至關重要的作用。通過識別蛋白質複合體結合界面上的關鍵位點和界面拓撲結構，可以準確定位藥物靶點，從而幫助研究人員針對結合界面的關鍵位點開發特異性結合的小分子或肽基化合物，這在抗腫瘤靶向藥物的研發中有巨大的應用價值。

二、作用機理

蛋白質功能通過蛋白質的相互作用進行表達 , 蛋白質與蛋白質相互作用的界面上並非所有的位點都是重要的 , 有時只有少數關鍵位點對蛋白質的結合起著關鍵的作用 , 這些起關鍵作用的位點稱為熱點。基於小分子染料的新型蛋白質標識技術可以用於識別蛋白質複合體在結合界面上的關鍵位點，其作用機理如圖1所示。

圖 1 蛋白質標識技術通過使用分子染料阻斷非界面區域的胰蛋白酶裂解位點進而揭示蛋白質 - 蛋白質相互作用的熱點。

A）PD1/PD-L1 蛋白質複合體和過量的小分子染料混合後，染料分子覆蓋了蛋白質表面溶劑可及的區域，但不能吸附到溶劑不可及的界面區域。未吸附的染料分子可以通過膠體過濾法去除。B）蛋白質複合體在尿素作用下發生變性反應，原本溶劑不可及的結合界面重新暴露。胰蛋白酶可以分離出暴露區域的精氨酸殘基和賴氨酸殘基（如 PD-1 中的K78）K78)。這些殘基經過質譜分析測定後，可以定位結合界面的關鍵點位。

首先，蛋白質複合體與過量的小分子染料混合後，小分子染料以非共價鍵形式覆蓋蛋白質複合體的「溶劑可及」的非界面區域，而「溶劑不可及」的界面區域則不能吸附小分子染料（圖1-A）。然後，蛋白質複合體在尿素作用下發生變性反應，複合體解體形成若干多肽鏈或蛋白質單體。重新暴露的界面區域與溶劑接觸，在胰蛋白酶的作用下分解成小分子肽；非界面區域在吸附的染料分子保護下阻斷了其與胰蛋白酶的接觸，從而避免分解並保持蛋白質結構（圖 1-B）。由於溶劑中的小分子肽來自界面區域蛋白質的分解，因此通過質譜分析法測定小分子肽，可以精確地識別蛋白質複合體在結合界面上的關鍵位點以及界面拓撲結構。結合界面上的關鍵位點可以作為藥物靶點，因此關鍵位點的識別在小分子或肽基靶向藥物的開發中有重要意義。

三、技術優勢

藥物研發中，蛋白質 - 蛋白質的相互關係不是常用的靶點選擇，這主要是因為傳統方法難以定位蛋白質複合體的結合界面：a 缺乏蛋白質複合體的晶體結構信息，導致難以識別精確地界面區域和界面拓撲結構，而且蛋白質複合體在非生理條件下形成的空間構象也不能準確地描述其在生理條件下的構象；b 有些空間構象不穩定或無定形態的蛋白質必須通過結構修飾或者與配體形成穩定的共結晶才能獲取其晶體結構信息；c 傳統晶體學技術難以揭示哪一種分子間的相互作用是蛋白質 - 蛋白質結合的主要親和力；d 用於識別蛋白質 - 蛋白質結合界面的其他非晶體學技術，例如羥基自由基標記法、氫氘交換法或化學交聯法等，通常操作複雜並且在非生理溶液條件下容易產生假陽性結果。

這種新型的蛋白質標識技術和傳統方法相比有以下優點：

1. 染料分子吸附數量可以量化，有助於篩選高親和力的小分子染料

作者發現吸附在蛋白質表面的染料分子的數量與蛋白質的表面積成線性相關，有助於根據吸附的染料分子數量篩選出高親和力的小分子染料。本研究測試了 FBBNA 和 FBBHA 等幾種候選染料與甲狀腺球蛋白的結合情況，研究發現在平衡狀態下，平均每個甲狀腺球蛋白分子吸附 57 個 FBBNA 分子結合或者 6 個FBBHB 分子。因此，FBBNA 的蛋白質親和力高於 FBBHA，是更理想的小分子染料。

2. 熱處理條件下染料分子不易脫落

有些蛋白質（如脫鐵鐵蛋白）結構穩定，因此在接受胰蛋白酶處理和質譜分析之前，需要熱處理使蛋白質完全變性，這要求蛋白質和染料分子在熱處理條件下仍然保持結合狀態。作者研究了脫鐵鐵蛋白經過熱處理發生變性反應後，FBBNA 小分子染料與蛋白質結合的分子數量，發現蛋白質與染料分子依然保持結合狀態，這表明 FBBNA 是一種良好的小分子染料標記物。

3. 染料分子可以穩定蛋白質結構，阻止蛋白質變性

作者研究了 FBBNA 和 AO50 兩種小分子染料對牛血清白蛋白（BSA）在尿素作用下發生變性反應前後蛋白質結構的影響。研究發現，FBBNA 和 AO50 不會影響 BSA 的蛋白質二級結構②且二者在一定程度上穩定了 BSA 結構阻止其變性。

4. 生理溶液作為反應介質

羥基自由基標記法、氫氘交換法等其它用來識別蛋白質 -蛋白質結合界面的非晶體學技術一般採用非生理溶液條件，因此往往操作複雜而且容易出現假陽性結果③。小分子染料標記法由於採用生理溶液作為反應介質，在可操作性和可靠性上具有優勢。

四、改進方向

基於小分子染料的蛋白質標識技術在識別蛋白質結合界面區域的關鍵位點上已顯示出巨大的實用性，但是該方法仍然需要進一步優化：

1. 引入更多的蛋白酶

本文中的蛋白質標識技術基於胰蛋白酶的實驗結果。研究表明，蛋白質結合界面的關鍵位點在精氨酸和酪氨酸殘基中均有富集。胰蛋白酶僅能作用於精氨酸殘基，而進一步識別位於絡氨酸殘基上的關鍵位點則需要引入其它蛋白酶。作者將在後續實驗中引入胰凝乳蛋白酶，並且將來可能會添加更多的蛋白酶以提高蛋白質標記技術的解析度。

2. 尋找對多種蛋白質有高親和力的小分子染料系列

當前研究對高親和力染料分子的篩選標準是：單一蛋白質吸附的染料分子數量越多，則認為其親和力越高。然而，這種篩選標準會忽略一些與蛋白質結合數量較少但是親和力高的小分子染料。此外，後續研究將會引入多種蛋白酶，因此篩選出與多種蛋白質有高親和力的小分子染料有重要意義。

3. 擴大標準蛋白質的備選庫

各種技術手段需要用到多種標準蛋白質。例如，BSA 蛋白具有較高的信號噪音比，可用於圓二色（circular dichroic,CD）光譜分析，而碳酸酐酶由於較大的 β- 摺疊結構④，而不能用於 CD 光譜分析。因此，擴大標準蛋白質備選庫可以確保能夠找到適用於各種技術手段的標準蛋白質，這對該項技術的發展非常重要。

五、實例分析

1. 針對 YAP/ZO-1 複合體結合界面的解析

YAP 即 Yes-associated protein，是一種轉錄共激活蛋白，是 Hippo 信號通路⑤的主要轉錄調節因子。YAP 通過Hippo 信號通路調節細胞分裂、細胞生長、細胞凋亡，繼而控制細胞的行為和動物器官的生長。YAP 的異常調控會引起腫瘤發生，因此，以 YAP 為基礎所組成的複合體可能是一個重要的藥物靶點。

然而 YAP 在自然條件下空間結構有一定程度的無定形狀態，難以通過晶體學技術識別其結合界面，因此 , 傳統技術對於 Hippo 信號通路的藥物研發一般集中在 YAP 的配體。本研究應用新型的蛋白質標識技術對 YAP/ZO-1 複合體進行解析⑥，發現了於 YAP 和 ZO-1 結合界面上的幾處關鍵位點（R89、R161、R187 和 K592），說明該技術能夠用於結構不穩定或無定形結構的蛋白質。

2. 針對 PD-1/PD-L1 的靶向抑制劑篩選

PD-1（programmed cell death protein 1）是包含268 個胺基酸的 I 型跨膜蛋白，屬於 CD28 超家族成員，可在T 細胞、B 細胞等免疫細胞表面表達。PD-L1 是 PD-1 的配體蛋白，被認為是最重要的免疫檢查點之一。PD-L1 與 PD-1 結合後可誘導 T 細胞凋亡、失能、耗竭，進而抑制腫瘤抗原特異性 CD8+T 細胞的激活、增殖和抗腫瘤功能，實現腫瘤免疫逃逸。基於此，PD-1 和 PD-L1 抗體屬於成功的癌症抗體療法之一。

針對 PD-1/PD-L1 複合體結合界面的小分子抑制劑報導甚少，而且百時美施貴寶公司（Bristol Meyers Squibb ）開發的界面靶向化合物有細胞毒性高、療效差的問題。本文作者提出利用新的蛋白標識染料來首先識別晶體學中 PD-1/PD-L1 界面關鍵點位，然後針對性的篩選能夠阻斷 PD-1/PFL1PD-1/PF-L1 複合體的形成的小分子肽，這些小分子肽可作為先導化合物進行再優化並作為模板以開發針對 PD-1/PD-L1複合體的小分子抑制劑。在本研究中作者發現位於 PD1 界面區域的 K78 位點。針對 K78 位點的結構特徵，研究團隊設計了八種小分子肽抑制劑，再接著選用 BPS Biosciences 公司提供的 PD-1/PD-L1 相互作用試劑盒，測定這些肽抑制劑破壞PD-1/PD-Ll 複合物的能力。結果發現在抑制劑濃度為 10nM100nM 時，基於錯位的 PD-L1 界面序列設計的抑制劑 ( 抑制劑 3 和 4) 沒有效果，其餘抑制劑有效濃度為 100μM，其中最有效的抑制劑 1 和 2 的 IC50 值低於 10μM。並按照 IC508 小於 10 微摩爾的標準篩選出兩種對 PD-1/PD-L1 複合體有良好阻斷效果的抑制劑（圖 2），這說明該技術可以用於靶向藥物的開發。

圖 2 圍繞 PD-1/PD-L1 複合物中熱點進而設計抑制劑來破壞該複合物的形成。

A）針對 K78 位點的結構特徵設計的八種小分子肽抑制劑在 10 nM 至 100 M 的濃度範圍內對 PD-1 和 PD-L1 組成複合體的抑制作用 , 並篩選出 IC50<10 μM 的有效抑制劑。B) PD-1/PD-L1 複合物（PDB 4ZQK）的晶體結構，其中用黃色填充模型表示 PDL1，紅色帶狀模型表示 PD-1，藍色填充模型表示基於 PD-L1 界面篩選出的抑制劑 1 的殘基。

六、總結與思考

蛋白質間相互作用的發生一般依賴特定的位點，然而基於靶向和識別的困難，藥物的研發過程往往因此而受限，這也意味著圍繞蛋白相互作用展開探索在藥物研發領域中具有重大價值。過去幾年間，圍繞細胞穿膜肽、多肽的口服穩定性以及多肽的構象靈活性的研究正處於大量開展中。這些改進方案都有望繼續推動小肽成為未來靶向蛋白質 - 蛋白質相互作用的可行候選藥物。基於小分子染料的蛋白質標識技術具有獨特性，一方面在藥物研發過程中不需要詳細的蛋白質晶體結構信息就可以識別結合界面的關鍵區域，另一方面也不要求非生理溶液的實驗條件。因此，該技術在進一步優化後將有助於在藥物研發中針對關鍵位點篩選出更多的先導化合物。

注釋：

①信號通路（signal pathway）是能將細胞外的分子信號經細胞膜傳入細胞內並產生細胞應答的一系列酶促反應通路。細胞外的分子信號稱為配體（ligand），包括激素、生長因子、細胞因子、神經遞質以及其它小分子化合物。細胞通過受體蛋白（receptor）能夠特異性地結合細胞外信號，將其轉變為細胞內信號，經過放大、分散和調節，產生一系列綜合性的細胞應答反應，包括下遊基因表達的調節、細胞內酶活性的變化、細胞骨架構型和 DNA 合成的改變等。https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/pathway/Reactome:R-HSA-162582

②蛋白質二級結構（secondary structure of protein）是指多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或摺疊而形成的特定的構象，即肽鏈主鏈骨架原子的空間位置排布，不涉及胺基酸殘基側鏈。蛋白質二級結構的主要形式包括 α- 螺旋、β摺疊、β- 轉角和無規捲曲。https://baike.baidu.com/item/ 蛋白質二級結構

③假陽性結果是指由於環境因素、操作因素、實驗方法或者患者自身因素等，可能把不具備陽性症狀的人檢測出陽性的結果。https://baike.so.com/doc/6080717-6293812.html

④β- 摺疊結構是蛋白質的二級結構，肽鍵平面摺疊成鋸齒狀，相鄰肽鏈主鏈的 N-H 和 C=O 之間形成有規則的氫鍵，在 β- 摺疊中，所有的肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與 β- 摺疊的長軸呈垂直關係。https://baike.so.com/doc/5248767-5481924.html

⑤Hippo 信號通路是一條進化上非常保守的通路，可通過調控細胞增殖、凋亡及幹細胞自我更新來控制器官大小。此外，Hippo 通路的失調會導致癌症發展。Badouel C, McNeill H (2011) SnapShot: The hippo signaling pathway. Cell145(3),484–484.e1.

⑥ZO-1, a scaffolding protein of the tight junction, 即為緊密連接蛋白，參與維持黏膜上皮機械屏障和通透性，不但參與調節細胞物質轉運和維持細胞極性，還參與細胞分化，腫瘤細胞遷移，基因轉錄等過程的的信息轉錄和調控。http://www.docin.com/p-925503934.html

文章來源

Protein painting, an optimized MS-based technique,reveals functionally relevant interfaces of the PD-1/PD-L1 complex and the YAP2/ZO-1 complex[J]. Journal of Biological Chemistry, 2019, 294.

編譯：江曉波 羅彧，責任編輯：王楠

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