環境分析中病毒的檢測
病毒的檢出及其濃度測定方法與細菌的相類似(即對樣品進行培養之後觀察生活病毒的生長效應)。但因病毒只能在活細胞內增殖,所以使用活的有機體如動物或組織培養作為病毒生長的培養基。涉及環境樣品的主要問題是腸道病毒可能引起的健康危害。這些是由人體腸道分泌出來的各種病毒。通常用組織培養來檢驗樣品中存在的病毒。這些是例如得自猴子腎臟的活細胞培養。腸道病毒在這種培養基上生長良好。
將細胞的懸浮液傾入充滿營養介質的容器如培養皿或管中。細胞本身即附著於器壁,並在容器內增殖形成一個單細胞層。當向培養液中引入含病毒的樣品時,病毒即感染其中的一些細胞。病毒在這些細胞內部增殖,並波及到相鄰的細胞。這就使細胞內部發生變化並終於死去。這種培養中細胞的毀壞情況稱為「細胞病變效應」(CPE)。病毒從細胞到細胞的擴展過程可由在單層細胞上覆蓋一層瓊脂而使之變慢。於是由一個病毒所引起的CPE就局限於細小的面積,看起來就像單細胞層上的一個空洞。這些空洞稱作噬菌區。
此效應可用來測定樣品中的病毒數目,只需象在標準平板上計數細菌菌落那樣對噬菌區進行計數。在此情況下,對於形成一個噬菌區的最低濃度就稱為「噬菌區形成單位」(PFU)。另一個測定濃度的方法是連續地稀釋樣品並接種入組織培養管中。這些管子中的樣品經過保溫培育,並確定50%接種管中給出的CPE的稀釋度。這一數量就稱為「組織培養感染劑量」-50%(TCID)。使用與細菌相同的技術,也可測定MPN。對特定病毒的陽性鑑定是用抗血清作出的。它是依據這樣的事實,即專一的抗血清將會中和病毒的作用,這種血清是針對該特定病毒所製備的。
許多種生物樣品例如貝類可以富集病毒,所以將貝類組織製成勻漿就可獲得足夠濃度的病毒。病毒也可吸附在顆粒狀物質上,因而就可對土壤和沉積物的樣品進行處理,使病毒解吸出來以供分析。水樣中病毒的濃度可能很低,也許為每升1PFU。在正常的病毒學操作中,接種培養基所用的樣品量是1毫升或稍少些,所以病毒的檢測需要通過某種形式的濃縮富集。實際上測定水中病毒的技術學就是富集病毒的方法。有一種操作程序就是使用濃縮的培養基,以使供測試的水大部分可進入培養基。這樣,試驗的樣品體積可為其它情況下的10~20倍。
其一種富集病毒的採樣方法是「紗網襯墊法」。這是從水中分離細菌的「穆爾( Moore)拖擦法」的改良方法。將紗網襯墊浸沒在採樣的河流或湖泊中。經過幾分鐘到幾天,病毒即吸附在襯墊上。取出襯墊可從其上將病毒洗脫下來。對洗脫下來的液體再作進一步的濃縮可增高方法的靈敏度。也曾發現當水通過膜濾器時,即使濾器的孔徑大於病毒10~20倍,病毒也能被吸附在其基體上。在大量水通過濾器之後,用表面活性劑溶液洗脫病毒。病毒的分離也可由超離心法來完成。較大的顆粒如細菌在低速離心時首先被除去。
然後將樣品在離心力約60000g的轉速下離心一小時。因為病毒的大小範圍在20~200納米,所以須用很高的離心力。對於樣品的水分可將樣品置於浸沒在親水試劑如聚乙二醇中的透析袋內而被抽取掉。也可採用艾伯特森的相分離法來富集病毒。本方法利用這一事實,即向水中加入兩種聚合物如葡聚糖硫酸酯和聚乙二醇時就形成一個兩相體系。水中的顆粒物質將根據其粒度和表面特性而在兩相之間進行分配。病毒將幾乎全部聚集在其中的一個相申,因而得到富集。可重複此種操作程序而獲得多級富集過程。病毒也可吸附在顆粒物質上。曾用各種不同的沉澱反應來將病毒收集到小體積的固體材料上,隨後可將它們再懸浮在小體積的水中。