CRISPR首次在美用於癌症患者!T細胞被改造後,能夠持續攻擊殺死腫瘤

CRISPR-Cas9基因編輯提供了強大的工具，可增強人類T細胞抵抗癌症的天然能力。

近日，頂尖學術期刊《科學》（Science）在線發布了一項癌症免疫療法的臨床試驗最新進展。其中，研究人員開展了一項首次在人類身上進行的I期臨床試驗，以測試3名難治性癌症患者中進行CRISPR-Cas9多重編輯以工程改造T細胞的安全性和可行性。

研究人員在T細胞中刪除了兩個編碼內源性T細胞受體（TCR）鏈的基因TCRα（TRAC）和TCRβ（TRBC），以減少TCR錯配並增強合成的癌症特異性TCR轉基因的表達（NY-ESO- 1）。他們去除編碼PD-1（PDCD1）的第3個基因，以提高抗腫瘤免疫力。將工程化的T細胞過繼轉移到患者體內導致持久移植，並在所有三個基因組位點進行編輯。儘管檢測到染色體易位，但頻率隨時間降低。修飾的T細胞可持續長達9個月，這表明在這些條件下免疫原性極低，證明了CRISPR基因編輯用於癌症免疫療法的可行性。

這項研究的共同通訊作者之一是癌症免疫療法知名科學家、CAR-T細胞療法先驅Carl June教授。他表示：「首先，我們可以成功地在製備細胞過程中精確地多次編輯，讓細胞在人體內的存活時間比過去公布的數據更長。其次，目前為止，這些細胞表現出持續攻擊並殺死腫瘤的能力。」

這一結果讓基因編輯技術應用於癌症治療方面展現出了令人期待的潛力，並可能為治療或消除無數人類遺傳疾病提供希望。

基因編輯的目的是以單鹼基對的精度改變細胞的DNA。該原理首先在哺乳動物細胞中得到證實，當時它表明稀有切割核酸內切酶的表達可產生雙鏈DNA斷裂，可通過同源和非同源重組進行修復。然後開發了多種工程核酸酶以提高效率並實現潛在的治療應用，包括鋅指核酸酶、歸巢內切核酸酶、轉錄激活因子樣效應核酸酶和CRISPR–Cas9（與Cas9內切核酸酶相關的聚類的規則間隔的短回文重複序列）。

使用基因組編輯的第一項人類試驗試驗是在HIV/AIDS患者中進行的，通過靶向白細胞蛋白CCR5，目的是通過非同源重組使基因突變，從而誘導對HIV感染的抵抗力。原則上，在CRISPR–Cas9中整合多個指導序列可在哺乳動物基因組中的多個位點進行多重基因組工程。

CRISPR促進高效多重基因組編輯的能力極大地擴展了可能的靶向遺傳操作的範圍，從而實現了新的可能性，例如在單輪誘變中同時刪除或插入多個DNA序列。使用CRISPR工程來治療多種疾病的前景越來越接近現實，例如遺傳性血液疾病和失明。

CRISPR-Cas9技術的最新進展還允許在人類T細胞中進行有效的DNA修飾，這對於增強癌症治療的功效具有廣闊的前景。 T淋巴細胞是專門的免疫細胞，在很大程度上是現代癌症免疫療法革命的核心。T細胞受體（TCR）複合物位於T細胞的表面上，並且是通過識別與MHC分子結合的外來抗原/肽來成功啟動抗腫瘤反應的關鍵。

癌症免疫療法最有前途的領域之一是過繼細胞療法（adoptive cell therapy）。在這一過程中，患者自身的T細胞經過基因工程改造，可以表達可特異性檢測和殺死腫瘤細胞的合成（轉基因）TCR。最近的研究表明，對於患有骨髓瘤、黑色素瘤和肉瘤的患者，採用對免疫原性NY-ESO-1腫瘤抗原具有特異性的轉基因TCR，這種過繼T細胞轉移方法的安全性和有希望的療效。這種方法的局限性在於，轉基因TCR已顯示與內源TCR的α和β鏈錯配和/或競爭表達。治療性TCRα和β鏈與內源性α和β鏈的配對不當會降低治療性TCR細胞表面表達，並可能產生自反應性TCR。

過繼轉移的T細胞的另一個缺點是誘導T細胞功能障礙或衰竭，導致功效降低。具有轉基因TCR的PD-1缺陷同種異體小鼠T細胞顯示出對同種抗原的增強應答，表明T細胞上的PD-1蛋白在可能是細胞內在的抗原應答中起負調控作用。在患有慢性淋巴細胞性脈絡膜腦膜炎病毒感染的小鼠中過繼轉移PD-1缺陷性T細胞可導致細胞毒性增強，後來導致終末分化T細胞的積累增強。PD-1的抗體阻滯或PD-1編碼基因（即PDCD1）的破壞/敲低，改良的嵌合抗原受體（CAR）或TCR T細胞介導的體外殺傷腫瘤細胞並增強PD-L1 +的清除率體內腫瘤異種移植。

但在T細胞療法的基礎上，CRISPR-Cas9基因編輯技術為增強T細胞的天然抗癌能力進一步提供了強有力的工具。在臨床前研究中，研究人員和其他人發現，用CAR轉導的CRISPR–Cas9介導的人T細胞中PDCD1的破壞增強了異種移植物中的抗腫瘤功效。特異性針對癌症抗原NY-ESO-1的轉基因TCR T細胞與靶向PD-1的單克隆抗體的過繼轉移增強了小鼠的抗腫瘤功效。因此，他們設計了一項首次在人類中進行的I期人類臨床試驗，以測試用於合成生物學癌症免疫療法應用的CRISPR-Cas9基因組多重編輯的安全性和可行性。

在插入TCR之前，研究人員用CRISPR技術敲除了T細胞內的3個基因。其中，兩個是T細胞自帶的TRAC、TRBC和基因，這樣可以避免天然的TCR與基因工程插入的受體產生錯誤配對或競爭，提高治療性TCR的作用。

而第3個基因則是PDCD1靶向T細胞，以增加表達NY-ESO-1 TCR的工程細胞的安全性。原則上，該策略能夠增加外源TCR表達並減少混合異二聚體形成的可能性（即通過分別刪除α和βTCR結構域基因TRAC和TRBC），並限制T細胞衰竭的發展。由檢查點配體PD-L1和PD-L2觸發（即刪除PDCD1）。

結果

以前的研究顯示，這些細胞在幾天內就會失去功能，而現在的結果顯示，經過CRISPR編輯的細胞在單次注射後能在相當長的一段時間內保持抗癌功能。

在製造過程中，將細胞從癌症患者體內取出，進行工程改造，然後再注入人體。經基因工程改造的T細胞產物被稱為「 NYCE」（NY-ESO-1轉導的CRISPR 3X編輯細胞）。在該協議的臨床開發過程中，研究人員們選擇使用TCR而不是CAR，因為使用TCR時細胞因子釋放症候群的發生率普遍較低。

原則上，與先前針對轉基因TCR的針對NY-ESO-1的臨床試驗中觀察到的不良事件基線較低水平相比，使用Cas9進行基因編輯是否具有潛在的免疫原性或毒性具有更加區分性的評估。通過慢病毒轉導工程化自體T細胞，以表達對HLA-A2 * 0201限制性的TCR特異性的NY-ESO-1和LAGE-1中的SLLMWITQC肽。材料和方法部分描述了NYCE T細胞的製造過程、載體設計和臨床方案，並進行了示意性描述（圖S1和S2）。在最初招募的6名患者中，有4名患者成功改造了T細胞，並按照FDA接受的研究性新藥（IND）申請（表S1）中的規定進行了詳細的釋放標準測試。

在4名擁有細胞產品的患者中，1位分配了唯一患者編號（UPN）的患者27經歷了快速的臨床進展，由於無法滿足協議規定的安全標準而不再符合輸液條件（請參閱補充材料）。最後，在3名接受CRISPR-Cas9工程改造T細胞輸注的患者中，2名患者患有難治性晚期骨髓瘤，1名患者患有難治性轉移性肉瘤，他們過去接受過的標準療法都顯示無效（表1）。在第-5至-3天（即在給予CRISPR-Cas9工程T細胞給藥之前）對患者進行環磷醯胺和氟達拉濱的淋巴結放化療，每天每公斤輸注1×108製造的CRISPR-Cas9工程T細胞協議的0（圖S2）。沒有向患者施用細胞因子。

也就是說，經過這幾重基因編輯的T細胞沒有導致治療相關的嚴重不良反應，並且顯示出了持久的存活和擴增能力。

接受T細胞回輸後，在最長達9個月的時間內，患者體內仍可以檢測到經過基因編輯的工程化T細胞。並且，當研究人員從患者體內分離出經基因編輯的T細胞，帶回實驗室測試，發現它們仍有殺死癌細胞的能力。

研究人員們期待，這一項在基因編輯方面的突破性發現，可以為後期研究提供有用的參考，並且有可能將其擴展到癌症治療的更多方面。

附：

表1 患者的人口統計資料和工程T細胞輸注的日期

圖1 CRISPR-Cas9 NYCE T細胞工程的可行性

（A）CRISPR-Cas9 NYCE T細胞的示意圖。 （B）NYCE T細胞的大規模擴增。自體T細胞用Cas9蛋白轉染，該蛋白與針對TRAC，TRBC（即內源性TCR缺失）和PDCD1（即PD-1缺失）的單個嚮導RNA（核糖蛋白； RNP複合物）複合，然後用慢病毒載體轉導以表達轉基因NY-ESO-1癌症特異性TCR。細胞在動態培養中擴增8至12天。在培養的最後一天，收穫NYCE T細胞並將其冷凍保存在不溶性培養基中。對所有4個受試者（UPN07，UPN27，UPN35和UPN39）繪製了培養過程中富集的T細胞總數。 （C）通過流式細胞術確定收穫的輸液產品中的NY-ESO-1 TCR轉導效率。對表達活CD3和Vβ8.1或右旋體陽性淋巴細胞的數據進行記錄，並進一步對CD4和CD8陽性細胞進行記錄。（D）使用基於晶片的數字PCR測量NYCE輸液產品中TRAC、TRBC和PDCD1基因破壞的總細胞的頻率。所有數據代表至少兩個獨立的實驗。誤差棒代表平均值+/- SEM。

圖2：CRISPR-Cas9工程改造的T細胞的效力和免疫原性

（A）與工程化表達NY-ESO-1和螢光素酶的HLA-A * 0201陽性Nalm-6腫瘤細胞共培養的NYCE T細胞的細胞毒性。包括未經CRISPR-Cas9編輯的NY-ESO-1 TCR轉導的患者T細胞（NY-ESO-1 TCR）和具有TRAC，TRBC和PDCD1的CRISPR-Cas9編輯的未轉導T細胞（在此表示為CRISPR），包括對照（n = 4個患者T細胞輸注產品）。星號表示通過組間配對t檢驗確定的統計學顯著性（* P>

圖3 CRISPR-Cas9工程改造的T細胞在患者體內的持續擴增和持久性

論文來源：https://science.sciencemag.org/content/early/2020/02/05/science.aba7365。