Function of Thymol and Its Application in Animal Production
DOU Xiujing , FANG Chunyang , HUANGFU Yingxu , SHAN Anshan
Abstract：Thymol is a natural phenolic substance isolated from thyme and oregano, it is mainly used in traditional medicine, food and cosmetic industries. In recent years, thymol has received much attention as a potential and safe alternative to feed antibiotics. Therefore, this article reviews the role and mechanism of thymol in antibacterial, anti-inflammatory, antioxidant and immune, as well as its application in the production of different types of animals, in order to provide a reference for its future in-depth research and comprehensive development and utilization.
Key words：thymol biological function biological mechanism production and application隨著人民生活水平的不斷提高，人們對肉類的需求越來越大，使得企業不得不採取工業化集中養殖模式，但高密度養殖易造成疾病傳播。一般而言，為避免動物疾病，會在飼料中添加大量具有抑制作用的抗生素，以達到預防性治療的目的，但是長期使用抗生素會導致某些細菌產生抗藥性，還存在藥品殘留問題，這些殘留在動物產品中的抗生素或其產物對人類健康會造成很大的威脅。2020年我國飼料中全面禁止使用抗生素，以維護動物源食品安全和公共衛生安全。因此，抗生素安全替代品的開發刻不容緩。研究發現，百裡香酚具有抗菌、抗炎等活性，可廣泛應用於動物養殖業中。目前，百裡香酚已被歐盟委員會認定可作為食品中的調味劑，且被美國食品藥品管理局認定為公認安全的食品添加劑。由此可見，百裡香酚具有成為抗生素替代品的極大潛力。
百裡香酚全稱為5-甲基-2-異丙基苯酚(5-methyl-2-iso-propylphenol)，是一種從唇形科植物的揮髮油中提取出的單體物質。一般為無色或白色的晶體物質，分子式為C10H14O，相對分子質量為150.22，相對密度為0.979，微溶於水，易溶於有機溶劑，熔點為51.5 ℃，沸點為232.5 ℃。因其主要是從百裡草中提取分離，故名為百裡香酚。
2.1 抗菌作用
大量研究結果揭示了百裡香酚或含百裡香酚的植物都具有顯著的抗菌活性，且百裡香酚具有廣譜性，對大多數革蘭氏細菌有抑制作用。常見有沙門氏菌、百日咳桿菌、紫色色桿菌等革蘭氏陰性菌，以及金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌等革蘭氏陽性菌。但是百裡香酚對不同細菌的作用機理各不相同。例如，Qiu等研究發現，百裡香酚抑制金黃色葡萄球菌中α-溶血素、腸毒素A(enterotoxin A，SEA)、腸毒素B(enterotoxin B，SEB)的轉錄，導致他們的分泌量減少，從而降低了溶血和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的誘導活性。Barbosa等利用未處理的對照組和具有亞致死濃度的牛至精油、香芹酚和百裡香酚處理的試驗組進行對比，研究表明抗菌活性優先與百裡香酚的存在有關，且百裡香酚在DNA合成和蛋白質調節方面可起到幹擾作用。Upadhyay等通過體內試驗檢測到百裡香酚能在一定程度上降低單核增生李斯特菌的毒性，還能增強抗菌肽基因的表達能力，提高生命的生存能力。Dong等研究發現，百裡香酚在亞抑制濃度下可以通過抑制嗜水氣單胞菌基因的轉錄而顯著減少溶氣素的產生和生物膜的形成，說明百裡香酚具有抗群體感應活性。同時，Caceres等表示百裡香酚-香芹酚-化學型油是進一步研究抗生素設計和開發抗細菌耐藥性的最佳候選者。總之，百裡香酚可以通過抑制細菌中毒性物質的轉錄和翻譯，增強動物機體內某些抗菌基因的表達以及抑制細菌生物膜的形成，從而發揮抵抗細菌的作用。
此外，百裡香酚可以與其他物質共同作用增強抗菌活性。比如百裡香酚可作為抗生素佐劑和抗生素結合。Kissels等研究發現，百裡香酚對百日咳桿菌和溶血支原體的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)分別為1.250和0.625 mmol/L，當它與多西環素或替米考星合用時，經分數抑制濃度棋盤檢測其抗菌作用，結果顯示百裡香酚與抗生素共同作用殺菌效果顯著增強。百裡香酚可與香精油中揮發性化合物結合，Porter等發現白芥子揮髮油與百裡香酚共同抑制沙門氏菌，降低了抑制沙門氏菌所需的精油濃度，且具有一定的商業價值。百裡香酚還可與噬菌體結合，與單獨使用百裡香酚或噬菌體相比，可以大大減少雞肉製品中沙門氏菌的數量。
百裡香酚還可以抑制真菌細胞的生成。真菌的細胞壁和細胞膜對細胞的正常生命活動有重要作用。真菌細胞壁的主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，百裡香酚可通過抑制脂多糖的釋放破壞細胞壁的正常結構，發揮抗菌作用，並且對較低水平的幾丁質細胞壁的抗性更強。真菌細胞膜的主要成分為麥角固醇，百裡香酚會改變細胞膜的通透性進而影響細胞膜的完整性(圖 1)。Ahmad等通過試驗研究了百裡香酚對細胞生長和氫離子外排的抑制作用，表明百裡香酚的抗真菌活性與氫離子-ATP酶的抑制作用有關。總之，百裡香酚通過破壞真菌類細胞膜或細胞壁的正常結構起到抑菌的效果，並可與細胞壁或細胞膜幹擾劑聯合應用，進一步有效抑制真菌生長或繞過真菌對藥物的耐藥性。
圖1：百裡香酚的功能圖
Fig. 1 Function diagram of thymol
2.2 抗炎作用
炎症是由多種信號分子介導的複雜病理生理過程，信號分子由白細胞、巨噬細胞、肥大細胞等多種細胞產生。對於巨噬細胞而言，炎性過程主要通過核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路調節。因此，抑制細胞中的NF-κB和MAPK信號傳導是抑制炎症反應的重要靶點(圖 1)。NF-κB是一個轉錄因子，可激活大量的促炎症基因(細胞因子、趨化因子、黏附分子)的表達，在氧化應激、炎症和免疫反應中起重要作用。De Jesús等通過試驗說明NF-κB/Rel轉錄因子家族在炎症反應的起始和消退中起著核心作用，確定了NF-κB的亞基c-Rel轉錄因子為炎症基因的轉錄阻遏物。經研究發現，百裡香酚能抑制NF-κB信號通路，進而抑制TNF-α和支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)的產生，同時促進紅系衍生的核因子E2相關因子2(nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2)的表達。此外，百裡香酚還能顯著降低Fos蛋白(c-Fos)、活化T細胞核因子1(NFAT1)、活化T細胞核因子2(NFAT2)的表達，並且在蛋白水平上，會誘導應激活化蛋白激酶和信號傳導及轉錄激活蛋白磷酸化水平下降，從而起到抗炎作用。總之，百裡香酚通過抑制細胞中的NF-κB和MAPK信號傳導，降低或阻止毒性蛋白或毒性物質的產生，達到抗炎的效果。
對於一般的炎症疾病，如風溼性關節炎、胸膜炎、腹膜炎等，百裡香酚均具有抗炎、促癒合功能。其中對山羊子宮內膜炎症抑制的安全濃度為100 μg/mL，此濃度範圍內百裡香酚可抑制山羊子宮內膜細胞的炎症作用，減輕細胞的結構性損傷，但高於此濃度會顯著增強山羊子宮內膜細胞的通透性，損傷細胞。
2.3 抗氧化作用
氧化應激會對動物產生免疫抑制、減緩動物生長、降低生產性能以及引起臟器損傷等不良影響，其主要的細胞介質是多形核中性粒細胞(polymorphonuclear leukocytes，PMNs)，激活的PMNs會產生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS的分泌會引起脂質過氧化、胺基酸氧化、蛋白質裂解和DNA損傷，從而引發自我持續的炎症循環和氧化應激。因此，ROS的釋放和PMN的增加都是使機體發生氧化的原因。氧化細胞損傷的治療策略包括清除特異的毒性效應代謝物、增加特異的細胞內抗氧化系統以及使用具有抗氧化活性的藥物。酚類化合物具有氧化還原性質，在中和自由基和過氧亞硝酸鹽以及分解過氧化物方面起著重要作用，有關抗氧化活性的數據主要通過2，2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)測定法或脂質過氧化法的化學試驗收集。在生物體外，百裡香酚通過清除自由基以提高抗氧化能力(圖 1)。百裡香酚和過氧自由基易發生化學反應，其氫離子與自由基結合，生成中間產物苯氧自由基，快速與下一個自由基發生反應，從而將過氧自由基清除。張有林等[29]通過DPPH測定法研究百裡香精油對自由基的清除能力，發現百裡香精油對自由基的清除能力與濃度呈線性關係，百裡香精油濃度越大清除能力越強，因此可推斷百裡香精油具有一定的抗氧化作用。
在生物體內，其通過提高生物抗氧化酶活性以提高抗氧化能力(圖 1)。Güvenç等通過測定精子質量參數(活力、濃度、異常精子、活死精子比率)和生化參數(還原型穀胱甘肽、丙二醛含量和過氧化氫酶活性等)，並進行組織病理學檢測研究不同劑量的百裡香酚對精子質量氧化應激和抗氧化系統的影響，確定了使用百裡香酚可以調節酶活性，減少氧化損傷，增加動物機體抗氧化水平，並改善精子質量參數。但百裡香酚是如何發揮抗氧化作用目前並不清楚，有研究認為，植物精油含有某些抗氧化活性物質能提高機體抗氧化能力，其能與細胞表面受體結合，通過轉錄和蛋白質表達2個水平使抗氧化酶基因的表達量增加，機體抗氧化酶活性增強，從而提高機體抗氧化作用。
2.4 免疫調節作用
百裡香酚具有調節樹突狀細胞(dendritic cells，DC)生長成熟、增強T細胞活性、誘導細胞增殖、影響炎症反應等免疫調節作用。在現代醫學和農業生產方面具有一定範圍的應用。Gholijani等研究發現，百裡香酚可通過調節端激酶(c-Jun N)、信號轉導子和轉錄激活因子降低炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)和活化T細胞(nuclear factor of activated T cells，NFAT)基因的轉錄，使白細胞介素-2(IL-2)和幹擾素-γ(IFN-γ)的生成受到抑制，從而調節T細胞活性(圖 1)。Palabiyik等通過在細胞培養基中分別添加25、50、100 mmol/L的百裡香酚，對比發現，3種濃度均可提高細胞活力，並記錄到100 mmol/L的百裡香酚在24 h時效果最好，活性最強。同時Amirghofran等的研究發現，百裡香酚還能抑制同種異體T細胞應答，並且可以促進DC的成熟。DC是免疫系統中最有效的抗原呈遞細胞，可分為未成熟DC(immature DC，iDC)、半成熟DC(semi-mature DC，sDC)以及成熟DC(mature DC，mDC)。mDC具有激活初始T細胞、抗感染、引發特異性免疫反應等功能，而iDC或sDC可以促進機體產生免疫耐受，是躲避腫瘤免疫殺傷的機制之一。Li等通過試驗發現百裡香酚對膀胱癌細胞增殖有抑制作用，百裡香酚可應用於治療腫瘤方面。Palabiyik等通過百裡香酚與卡瓦酚(carvonol，Car)聯合治療肝癌，發現百裡香酚的治療效果優於卡瓦酚。Chauhan等發現百裡香酚不僅是一種良好的有絲分裂原，可使脾細胞的增殖顯著增加，而且還能增加膜流動性和增強巨噬細胞的吸收能力，同時也增加了巨噬細胞的溶酶體活性。此外，Ahmed等[38]研究發現，使用百裡香油和百裡香酚處理阿黴素(doxorubicin，DOX)的大鼠的腎臟和心臟中脂質過氧化作用顯著降低，而穀胱甘肽(glutathione，GSH)、酶促抗氧化劑(glutathione enzymatic antioxidant，GST)含量和穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)活性顯著增加，顯著改善了DOX引起的腎臟組織學變化，增強了大鼠的抗氧化防禦機制。綜上所述，百裡香酚提高免疫活性主要是通過緩解炎症反應、增加免疫物質含量和提高氧化損傷能力，但缺乏具體的機制研究，需要進一步有系統的研究。
2.5 其他
目前研究人員正在探究百裡香酚對神經活性和內在特性的影響，結果顯示百裡香酚可激活多種瞬時受體電位(transient receptor potential，TRP)非選擇性陽離子通道，其中包括TRPV3、TRPA1和TRPM8通道。TRP通道的調節，尤其是TRPA1，被認為是百裡香酚抗傷害性活動的潛在機制。Vatanparast等通過試驗研究了百裡香酚對白花蝸牛中樞神經元自發活動和動作電位的影響，發現百裡香酚(0.5 mmol/L)與鉀離子通道阻滯劑四乙基銨協同作用，不能引起蝸牛神經元突發放電，此結果也支持了鉀離子通道抑制。
此外，百裡香酚還表現出其他幾種生物活性，包括促生長、抗傷害、血管鬆弛素、基因毒性、殺蟲等特性。
百裡香酚具有抗菌、抗炎等多種功能，且添加到動物飼料中對生長性能、腸道菌群和動物福利都有積極作用。長期反覆吸入高劑量百裡香酚沒有發現慢性毒性。因此，百裡香酚在動物飼料生產領域備受關注。
3.1 在豬等哺乳動物生產中的應用
作為一種天然酚類物質，百裡香酚能更好的被動物吸收、消化、分解、代謝。在動物生長中能增強抗病能力、改善生產性能、保證產品質量，進而在豬飼料生產中具有良好前景(表 1)。在妊娠晚期和哺乳期觀察到系統性氧化應激的增加，使母豬產奶量不足，直接影響哺乳仔豬的健康和生長。飼糧中添加百裡香酚可顯著增加仔豬的體重和生長速度。為了降低成本，在豬的飼養中普遍應用早期斷奶技術，早期斷奶會導致仔豬出現「斷奶應激症候群」，使仔豬腸道屏障損傷，毒素等物質進入腸道產生免疫應答和分泌細胞炎性因子，使仔豬的消化能力和免疫能力變差。百裡香酚具有抗炎和抗氧化活性，可促進斷奶仔豬腸道吸收和增強其抗菌活性，有效地改善仔豬腸道微生物菌群。另外，百裡香酚和有機酸結合可有效促進腸道黏膜成熟，降低腸道通透性，促進早產仔豬的生長發育，且效果更佳。
3.2 在禽類生產中應用
禽類在養殖過程中，容易感染病毒和細菌而大量死亡，嚴重時還會影響人類的身體健康。因此，為了降低禽類感染機率、提高成活率和提高產品質量，在禽類養殖中需要一種廉價有效的抗菌物質作為飼料添加劑。百裡香酚可從自然植物中提取、來源便利，並且抗菌效果顯著，所以可作為禽類飼料添加劑使用。杜恩存、魏磊等研究得出百裡香酚對2種雞源常見致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌)均具有抑制作用，且作用效果明顯，這與其抗菌活性密不可分(表 1)。與此同時，百裡香酚在禽類養殖過程中可用作抗菌劑與肉桂醛共同對脂多糖誘導的肉仔雞炎症反應起免疫調節功能，主要是影響腸道微生物區系，改善腸上皮屏障功能、緩解產氣莢膜梭菌誘導的肉仔雞壞死性腸炎。此外，在飼糧中添加一定量的百裡香酚可提高肉雞的平均日增重，改善肉質，降低氧化反應。
3.3 在水產動物中應用
在水產動物養殖業中主要的殺菌方式是依靠殺毒劑和抗生素，但長時間的使用會產生細菌耐藥性和水體汙染等問題。植物精油具有高效的抗菌活性，可用於防治水產動物細菌性疾病。百裡香酚、香芹酚、丁香酚和肉桂醛4種常見的植物精油成分中，百裡香酚的殺菌效果最明顯。研究發現，百裡香酚作為飼料中的誘食劑，在誘食、促進攝食、改善肉質等方面發揮積極作用，可促進虹鱒生長、提高增重率及降低飼料係數；提高羅非魚生長性能，增強脂肪酶活性(表 1)。同時，飼料中添加一定量的百裡香酚會使黃顙魚體重迅速增加，其主要原因是對神經肽(neuropeptide Y，NPY)mRNA表達產生影響。魚類在飢餓狀態下，其腦部中的NPY mRNA表達量較飽食狀態下明顯增加，呈現出強烈的攝食慾望，從而促進攝食能力。
百裡香酚是一種純天然的植物提取物，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種活性，在動物生產中具有很大潛力。但有研究發現，百裡香酚對動物皮層和黏膜等組織有刺激作用，濃度過高還會損壞肝臟和腎臟，因此使用時需注意用量。此外，由於環境等因素的限制，天然百裡香酚的成本很高。目前主要依靠間甲酚和丙烯或異丙醇等經傅-克烷基化反應人工合成，在生成百裡香酚的同時也產生很多副產物，如2-異丙-3甲基酚、4-異丙基-3-甲基酚和3-甲基苯-異丙基醚等，均具有一定毒性，若處理不當會嚴重汙染環境。但現在已有研究出百裡香酚的最佳工藝條件為：以平均孔徑為7.48 nm的大孔γ-Al2O3為催化劑，反應溫度為250 ℃，間甲酚與丙烯的摩爾比為1:2，空速為0.87 mL/(g·h)，在此條件下，百裡香酚獲得最大生產率為73.0%。希望通過不斷的探索和完善，百裡香酚能早日大規模投入生產中，實現其在動物生產中的廣泛應用。
來源：動物營養學報
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