中國科學家顛覆長壽基因認知 提出胎兒期死亡新解釋

1999年，科學家在最簡單的真核生物釀酒酵母中發現了具有延長壽命的Sir2基因。此後，在小鼠等嚙齒類動物中，Sir2的同源基因SIRT6同樣被發現有此魔力。自此，SIRT6被科學界奉為經典的「長壽基因」，成為人類掌控衰老速度的一個熱門突破口。

北京時間8月23日凌晨，中國科學院幹細胞與再生創新研究院等研究團隊在國際頂級學術期刊《自然》（Nature）刊發歷時3年的一項最新的合作研究成果：首次實現SIRT6在非人靈長類動物中的全身敲除，獲得了世界上首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型。

非人靈長類作為人類的「表親」，在基礎科研和醫學研究中具有其他模式生物無可比擬的優勢。國家傑出青年基金獲得者、幹細胞國家重大科學研究計劃首席科學家、中科院生物物理所研究員劉光慧是該項成果的通訊作者之一，他在接受澎湃新聞（www.thepaper.cn）採訪時表示，「關於SIRT6這個長壽基因在包括人在內的靈長類中所起的作用，例如是否可以調節衰老，此前由於研究手段的限制使得人們無法回答這個問題。」

有趣的是，這項初衷為解析長壽基因如何調節食蟹猴衰老的研究，最終卻顛覆了此前對長壽基因的傳統認知。一直致力於通過研究人類加速衰老疾病的機制來解決諸多老齡化問題的劉光慧等人，這次的注意力從生命終端被拉到了生命的起點：經典「長壽基因」的缺失居然導致食蟹猴在子宮內發育不良並出現出生後早夭。

首次在非人靈長類猴子身上得到的這一結論，讓劉光慧等格外興奮。「此前在嚙齒類等動物中看到的一些「加速衰老的症狀」可能並不完全是「衰老」的表型；根據基於食蟹猴的研究結果，SIRT6在胚胎發育早期的缺失可能更多的是延遲了機體的發育。SIRT6缺乏小鼠可能也具有發育遲緩的表型，但可能由於嚙齒類和靈長類動物具有較大的種屬差異，例如，小鼠具有更長的端粒等，所以SIRT6敲除的小鼠可以在出生後存活4周甚至更長的時間。」

值得注意的是，SIRT6導致食蟹猴子宮內發育遲緩這一點，目前在人類中也有了蛛絲馬跡。

就在劉光慧等人的論文發表前不久，美國有研究團隊在《基因與發育》（Genes & Development）發文，該研究團隊通過篩查流產胎兒發現，在人類SIRT6基因上的功能突變也會引起胎兒子宮內生長發育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。

劉光慧表示，「這實際上同我們在猴子身上看到結果非常類似，很好地佐證了我們的結論。」 SIRT6敲除猴子模型或可以為人類圍產期致死症候群的發病機理提供新的研究途徑。

除劉光慧之外，該研究的通訊作者還包括中科院動物研究所李偉研究員和胡寶洋研究員。中科院生物物理研究所張維綺研究員，中科院動物研究所萬海峰助理研究員、馮桂海副研究員和曲靜研究員為共同第一作者。中國幹細胞與生殖研究領域權威、中科院動物研究所研究員、中科院院士周琪也參與並指導了此項研究。

讓食蟹猴喪失長壽基因

Sirtuin蛋白家族本質上是一類從酵母到人類高度保守的去乙醯化酶，其備受關注源於和人類孜孜以求的長壽扯上了關係。

除釀酒酵母之外，線蟲、果蠅，直至到更高等一點的小鼠，科學家均發現有Sir2的同源基因存在。而在哺乳動物細胞裡，目前已知的Sir2同源基因有7個，即SIRT1至SIRT7。

相信紅酒有助長壽的人或許對SIRT1並不陌生。有研究者認為，紅酒中包含的白藜蘆醇（Reseratrol）能夠通過激活SIRT1來使得哺乳動物壽命延長。2008年，英國製藥巨頭葛蘭素史克（GSK）還付出7億多美元購得SIRT1藥物開發的一項技術。儘管如此，白藜蘆醇的作用機制和療效在科學界還存在著一定的爭議。

相比於SIRT1，人們認為SIRT6在衰老和壽命調控中同樣具有重要的作用。SIRT6敲除小鼠壽命會縮短，表現出加速衰老的特點，例如皮下脂肪缺失，脊柱彎曲、骨量減少、端粒縮短等。人們相信，SIRT6對於哺乳動物來說是一個經典的『長壽蛋白」，具有調控機體衰老的作用。

劉光慧表示，「目前人們廣泛應用的SIRT6敲除小鼠早衰模型具有重要的科學價值，不僅可以用於研究嚙齒類動物衰老的規律，而且人們可以利用這個模型進行藥物篩選和評價。具有延長早衰小鼠壽命活性的化合物可能對於人類衰老性疾病的防治具有提示和借鑑意義。」

然而，受限於基因編輯技術等原因，SIRT6這一重要的調控衰老的開關此前從未在猴子或人類身上被科學家隨意開啟或關閉。此前在2016年，劉光慧團隊僅在人類間充質幹細胞中通過基因編輯敲除SIRT6，並觀察到SIRT6的缺失確實能夠導致人幹細胞穩態失衡。

「高效、徹底地在猴子體內敲除特定基因的技術難度非常大，迄今為止還沒有敲除任何衰老和長壽基因的報導。」論文共同通訊作者李偉研究員提到，「需要在胚胎發育早期運用非常高效的CRISPR技術，這樣才能幹淨地敲掉SIRT6基因，使之後產生的機體的所有細胞都不再有這個基因。」

而在此番研究中，李偉和劉光慧等人藉助高效CRISPR–Cas9基因編輯技術最終成功獲得SIRT6全身敲除的食蟹猴。

研究團隊共製備98個食蟹猴受精卵， 其中48個發育、形態學正常的基因敲除胚胎被移植到12隻代孕猴子中。有4隻代孕猴子受孕成功，其中3隻完成了大約165天的懷孕周期，每隻均生下一隻小母猴。另一隻在懷孕中期流產了一隻公猴。

「早產兒」僅存活數小時

按照實驗計劃，研究團隊將會花上比在小鼠等模式動物身上多得多的時間來觀察食蟹猴的「早衰」。畢竟，如果一隻猴子的壽命能達到20餘年，樂觀一點的話，研究團隊希望在猴子出生後的1年至數年後能觀察到加速衰老的跡象。

不過，這些實驗預期在SIRT6基因敲除食蟹猴出生後的數小時後即被完全打破節奏。

論文中提到，SIRT6敲除猴子出生時明顯偏小，體重比野生型新生猴子約輕3.5倍，相當於這些野生型新生猴子在2-4個月胎齡時的大小。

「壽命只有幾個小時，這些剛出生的SIRT6敲除的猴子非常小，發育速度幾乎減慢了一倍，但它們還是足月生產出來了。這些「早產」的猴子在出生後是不能很好存活的，各器官組織都遠沒有達到可以在母體外存活的成熟度。」李偉表示。

也就是說，SIRT6敲除導致食蟹猴在子宮內出現了全身發育遲緩，導致類似「早產」而無法在出生後生存。

論文共同通訊作者胡寶洋提到，「我們檢測了SIRT6敲除的所有食蟹猴，在基因組和表觀基因組水平都沒有發現任何「加速衰老」的特徵，相反看到了更加不成熟的發育早期狀態。而皮下脂肪減少，骨密度減少，腸上皮受損等在SIRT6敲除小鼠中被認為是加速衰老的特徵，我們在SIRT6敲除食蟹猴身上同樣也看到了。不過，2-4個月胎齡的野生型猴子也具有類似的表型，說明這些未必是衰老的特徵。」

胡寶洋認為，或許科學家們在小鼠身上看到的相關異常並不完全是加速衰老， SIRT6在食蟹猴中的缺失阻滯了器官的發育，發育的時鐘被撥回到胎兒期的特定階段。「我們在猴子裡觀察到的許多現象與小鼠都不太一致。」

此外，同新生的野生型猴子相比，SIRT6敲除食蟹猴的腦更小，大腦和小腦半球的皮質層更薄，類似於野生型猴的胎兒。研究團隊認為，基於這些數據，SIRT6可能是食蟹猴腦發育過程中神經幹細胞分化的關鍵調控開關，SIRT6的缺失會推遲神經元的成熟。

研究團隊隨後在分子機制層面解釋已有的結論。他們比較了SIRT6敲除食蟹猴和野生型新生猴子7種器官中全基因組RNA的表達，鑑定出至少在一種器官中，兩者存在著多達11001個基因表達的差異。其中在至少四種器官中，有1026個基因表達存在差異。

而在所有存在表達量差異的基因中，長鏈非編碼核糖核酸 H19（最早被鑑定出的印跡基因之一，印記基因被認為與發育和很多疾病相關）上調最為明顯，在SIRT6敲除食蟹猴腦部的表達量是野生型新生猴子的27.5倍。

而此前有研究已經得出結論，H19表達在胚胎發育過程中對包括大腦在內的各組織發育具有非常關鍵的作用。

在人類中會如何？

在猴模型中，敲除經典「長壽基因」SIRT6帶來了顛覆性的新認知，那如果進一步延伸到人類，結果又會如何？人類的「表親」是否幫助準確預演了結果？

在研究衰老調控的同時長期研究幹細胞的劉光慧想到的是對人類幹細胞「動刀」。研究團隊採用TALEN基因編輯技術獲得SIRT6敲除的人類胚胎幹細胞，在細胞培養皿中進而將這種萬能的「種子細胞」誘導分化成神經前體細胞。

「我們利用現有的成熟的研究平臺，可以通過對人的幹細胞進行基因組編輯，進而研究定蛋白對人類幹細胞或終末分化細胞穩態的影響。」劉光慧提到，和眾多致力於建立非人靈長類疾病模型的團隊不同，他們更關注於將食蟹猴研究中發現的生物學規律在人類幹細胞中體系加以深入進一步研究和驗證。

研究團隊在人類神經幹細胞中得到了和在SIRT6敲除食蟹猴腦中類似的結論。SIRT6敲除的神經前體細胞表現出神經元分化的延遲，研究人員未能在顯微鏡下看到成片連接的特徵性神經元網絡。進一步發現，SIRT6敲除的人類神經細胞中也具有較高的H19轉錄本水平。

接下來的問題是，如果要疏通所謂的「通路」，研究團隊必須還要回答SIRT6是否直接控制H19表達？研究團隊最終發現，受SIRT6調控的乙醯化組蛋白H3K56ac（組蛋白H3第56位賴氨酸殘基乙醯化修飾）在其中是中間一環。

正常情況下，SIRT6能結合到H19上遊的印記調控區，SIRT6作為一種組蛋白去乙醯化酶可以使得組蛋白去乙醯化，從而導致H19轉錄沉默。由此在神經分化的過程中，H19轉錄水平並不會特別高，神經分化程序保持正常。

研究團隊稱，這也就意味著，SIRT6可以通過介導H19印記調控區的組蛋白去乙醯化來反式抑制H19的表達。

然而，在 SIRT6敲除的人類神經前體細胞模型中，看到的一個結果就是SIRT6的缺乏使得H3K56ac增多，同時還伴隨有更多的H19轉錄的反式激活因子CTCF。這些因素都導致H19升高，從而抑制神經分化。

實際上，在SIRT6敲除食蟹猴中同樣觀察到，H3K56ac在多種組織中均增加。和上述結論一致的是，SIRT6敲除食蟹猴中H19的表達因此而大幅增加。

SIRT6-H3K56ac-H19這條通路在實驗室條件下的人類幹細胞模型中被拼接完整。而在人體中，這條通路實際上也在若隱若現。

此前有研究證明，H19在人體中過量表達被證明和銀羅素症候群（SRS）相關。銀羅素症候群又稱先天侏儒症，發病率只有十萬分之一，它的特點即是嚴重的子宮內和出生後生長發育遲緩。

同樣有力的一點是，2018年3月，《基因與發育》發表美國科研團隊的一項成果顯示，人類中SIRT6的功能突變（D63H）會引起胎兒子宮內生長發育遲緩，最終在晚期引起胎兒死亡。

劉光慧表示，「該研究團隊主要通過篩查流產的胎兒，發現有某些胎兒攜帶有SIRT6單點突變，而突變位點剛好是去乙醯化酶的活性位點，他們看到的包括神經系統發育遲緩等表型，實際上跟我們在食蟹猴中看到的很類似，非常好地佐證了我們的發現。」

劉光慧認為，研究團隊建立了一個全新的人類出生前發育遲緩（圍產期致死）症候群的研究體系。「SIRT6作為表觀遺傳因子可以調節靈長類動物的出生前發育，而在臨床上，我們的發現有助於深入理解因子宮內發育遲緩而導致胎兒流產或新生兒死亡的分子基礎。接下來更為重要的科學問題是，在臨床上有多少胎兒發育遲緩的病例與SIRT6基因的突變有關，我們如何發展有效的生物醫學手段進行幹預和治療？」