一、分光光度法基本原理
在光譜分析中,依據物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:
紅外吸收光譜：分子振動光譜,吸收光波長範圍2.5~1000 μm ,主要用於有機化合物結構鑑定。
紫外吸收光譜：電子躍遷光譜,吸收光波長範圍200~ 400 nm(近紫外區)，主要用於結構鑑定和定量分析。
可見吸收光譜：電子躍遷光譜,吸收光波長範圍400~750 nm , 主要用於有色物質的定量分析。
當一束白光(混合光)通過某溶液時，如果該溶液對可見光區各種波長的光都沒有吸收，即人射光全部通過溶液，則該溶液呈無色透明狀。當該溶液對可見光區各種波長的光全部吸收時，則該溶液呈黑色。如某溶液對可見光區某種波長的光選擇性地吸收，則該溶液即呈現出被吸收波長光的互補色光的顏色。有色溶液：透過光的顏色
黑色：吸收所有顏色的光
白色：反射所有顏色的光（如：六價鉻與二苯碳醯二肼反應生成紫紅色物質，與540nm處比色）1729年和1760年：皮埃爾·布格（Pierre Bouguer）和約翰·海因裡希·朗伯（Johann HeinrichLambert）分別闡明了物質對光的吸收程度和吸收介質厚度之間的關係: A ∝ b1852年：奧古斯特·比爾（August Beer）又提出光的吸收程度和吸光物質濃度也具有類似關係: A ∝ c在光的吸收定律式中，比例常數k與入射光波長、溶液的性質有關。如果濃度c用mol/L為單位、液層厚度b以cm為單位，則比例常數稱為摩爾吸收係數以ε表示，單位為L/(mol•cm)。此時光的吸收定律可寫成:摩爾吸收係數是通過測量吸光度值，再經過計算而求得的。摩爾吸收係數表示物質對某一特定波長光的吸收能力。ε愈大表示該物質對某波長光的吸收能力愈強，測定的靈敏度也就愈高。因此進行測定時，為了提高分析的靈敏度，必須選擇摩爾吸收係數大的有色化合物進行測定，選擇具有最大ε值的波長作入射光。
同一物質的吸收光譜特徵值相同, (每一波長處吸光係數相同)。
同一物質不同濃度,其吸收曲線形狀相似,Amax相同。相同濃度的吸收曲線重合。
在光度分析中，利用吸光度A和濃度之間的線性關係測定物質含量。測定方法：配製一系列不同濃度的標準溶液，在一定條件下顯色，使用同樣厚度的吸收池，測定吸光度，然後以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得一條直線，稱為工作曲線或標準曲線。在同樣條件下，測出試樣溶液的吸光度，就可從工作曲線上查出試樣溶液的濃度c。比爾定律：只在一定濃度範圍內適用（只適用於濃度小於0.01mol/L的稀溶液），吸光度A和濃度才成直線關係。(2) 吸光物質為均勻非散射體系。（必須是透明溶液）(4) 輻射與物質之間的作用僅限於光吸收，無螢光和光化學現象發生。非單色光的影響:入射光為單色光是應用該定律的重要前提:單色器的質量反射和散色光的影響:散射和反射使T↓, A↑,吸收光譜變形。通常可用空白對比校正消除。非平行光的影響: 使光程↑, A↑,吸收光譜變形。 入射光選擇被測溶液吸收曲線較平直部分(高峰處)對應的波長。 避免測量體系是膠體溶液、乳濁液或懸浮液，樣品溶液的測量體系中光源：提供波長連續的複合光：①具有足夠的光強度；②光強在一定時間內保持穩定。（穩壓裝置）
鎢燈或滷鎢燈一可見光源350~1000nm；
氫燈或氘燈一紫外光源200~360nm
單色器：把複合光轉變為單色光：以稜鏡、光柵作為單色器。玻璃：用於可見光區；石英：適用於紫外光區。
稜鏡：對不同波長的光折射率不同
光柵：衍射和幹涉,不同波長的投射方向不同
吸收池：可見光度計：玻璃/石英材質；紫外光度計：石英材質 （1）手拿毛面；（2）裝2/3滿，事前潤洗2~3遍；（3）用鏡頭紙擦乾外周水滴，使光面乾淨； （4）位置放正；（5）測完後及時倒掉，衝洗乾淨；（6）保持比色皿的配套性檢測系統: 光信號 → 電信號，通過數據轉換，顯示吸光度值。光電倍增管比色皿校正：將純淨蒸餾水注入比色皿，以其中吸收最小的比色皿為參比，測定其他比色皿的吸光度。測定同一溶液時，同一組比色皿之間的差值應小於0.005，否則需進行校正比色皿洗滌：比色皿可用相應得溶劑刷洗，或用（1+3）HNO3浸泡比色皿的選擇：通常用10.0mm，（1-100mm），視所測溶液的吸光度而定，以其吸光度在0.1~0.7之間為宜
顯色反應：在光度分析中，將試樣中被測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應顯色劑：能與被測組分生成有色物質的試劑稱為顯色劑。顯色反應分為兩類：絡合反應和氧化還原反應，其中絡合反應是最主要的顯色反應。①選擇性好：一種顯色劑最好只與一種被測組分起顯色反應，或顯色劑與幹擾離子生成的有色化合物的吸收峰與被測組分的吸收峰相距較遠。這樣幹擾較少。③有色絡合物的離解常數要小，有色絡合物的離解常數愈小，絡合物就愈穩定。絡合愈穩定，光度測定的準確度就愈高，並且還可以避免或減少試要求樣中其它離子的幹擾。⑤如果顯色劑有顏色，則要求有色化合物與顯色劑之間的顏色差別要大，以減小試劑空白。一般要求有色化合物與顯色劑的最大吸收波長之差在60nm以上。⑥顯色反應的條件要易於控制如果條 件要求過於嚴格，難以控制，測定結果的再現性就差。
參比溶液(空白溶液)
純溶劑：當試液、 試劑、顯色劑均無色時,用溶劑(通常是純水)作參比液。
實驗室空白：不含待測組分的空白 ,在相同條件下與待測試樣同時行處理。
試樣本底：如果試樣中的其他組分也有吸收 ，但不與顯色劑反應,當顯色劑無吸收時,可用試樣溶液作參比溶液(扣除本底:色度或濁補償)
目的：減小截距，得到過原點的標準曲線，準確定量
測定波長
生成物溶液的最大吸收波長λmax ,靈敏度最好,幹擾最小吸光度一控制為稀溶液 ,吸光度在0.2~0.8 ;
顯色要求
定量反應、選擇性要好;幹擾少。生成的有色化合物組成要恆定,化學性質穩定。
有色化合物與顯色劑的最大吸收波長之差≥60nm。
顯色反應的條件要易於控制。
顯色條件
時間、用量、溫度、酸鹼性等
對於單一組分的測定，工作曲線法是實際工作中用得最多的一種定量方法 配製4個以上濃度或適當比例的待測成分標準溶液（除零點外5個），以空白溶液為參比溶液，在選定的波長下，分別測定吸光度。 以標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製工作曲線。 在測定樣品時按同樣方法製備待測樣品溶液，測定其吸光度,在工作曲線上即可查出待出物的濃度。在一定條件下，工作曲線是一條直線，直線的斜率和截距可以用最小二乘法求得。工作曲線可以用一元線性方程表示: y =a + b x，r使用最小二乘法確定的直線稱為回歸線，a、b稱為回歸係數。項目
標準方法檢出限測定上/下限氨氮可見光分光光度法水質 氨氮的測定 納氏試劑分光光度法 HJ 535-20090.025 mg/L (50mL)0.2~2.0 mg/L水質 氨氮的測定 水楊酸分光光度法 HJ 536—20090.01mg/L
(10 mm)0.004mg/L
(30 mm)0.04~1.0 mg/L (10 mm)
0.016~0.25 mg/L (30 mm)容量法水質 氨氮的測定 蒸餾-中和滴定法 HJ 537-2009 0.05 mg/L (250mL)
氣相分子吸收法水質 氨氮的測定 氣相分子吸收光譜法 HJ/T 195-20050.020 mg/L0.08~100 mg/L 連續流動分光光度法水質 氨氮的測定 連續流動-水楊酸分光光度法 HJ 665-20130.01 mg/L
(直比)0.04 mg/L
(蒸餾)0.04~1.00 mg/L
0.16~10.0 mg/L流動注射分光光度法水質 氨氮的測定 流動注射-水楊酸分光光度法 HJ 666-20130.01mg/L (10mL)0.04~5.00 mg/L總磷可見光分光光度法水質 總磷的測定 鉬酸銨分光光度法 GB 11893-890.01mg/L (25mL)＜ 0.6 mg/L流動注射分光光度法水質 總磷的測定 流動注射-鉬酸銨分光光度法 HJ 671-20130.005 mg/L (10mm光程)0.020~1.00 mg/L 連續流動分光光度法水質 磷酸鹽和總磷的測定 連續流動-鉬酸銨分光光度法 HJ 670-20130.01mg/L (50mm光程)0.04~5.00 mg/L氰化物可見光分光光度法水質 氰化物的測定 容量法和分光光度法 HJ 484-20090.25 mg/L(滴定法)
0.004 mg/L(異煙酸-吡唑啉酮)
0.001 mg/L(異煙酸-巴比妥酸)
0.002 mg/L(吡啶-巴比妥酸)1.00~100mg/L(滴定法)
0.016~0.25 mg/L
(異煙酸-吡唑啉酮)
0.004~0.45 mg/L
(異煙酸-巴比妥酸)
0.008~0.45 mg/L (吡啶-巴比妥酸)流動注射分光光度法水質 氰化物的測定 流動注射-分光光度法 HJ 823-20170.001 mg/L(異煙酸-巴比妥酸)0.002 mg/L(吡啶-巴比妥酸)0.004~0.10 mg/L(異煙酸-巴比妥酸)
0.008~0.50 mg/L (吡啶-巴比妥酸)揮發酚可見光分光光度法水質 揮發酚的測定 4-氨基安替比林分光光度法 HJ 503-2009 0.0003mg/L
(萃取)0.01mg/L
(直比)0.001~0.04 mg/L，
0.04~2.50 mg/L流動注射分光光度法水質 揮發酚的測定 流動注射-4-氨基安替比林分光光度法 HJ 825-20170.002 mg/L0.008~0.200 mg/L陰離子表面活性劑可見光分光光度法水質 陰離子表面活性劑的測定 亞甲藍分光光度法 GB 7494-870.05 mg/L (100mL，10mm光程)＜ 2.0 mg/L流動注射分光光度法水質 陰離子表面活性劑的測定 流動注射-亞甲基藍分光光度法 HJ 826-20170.04 mg/L0.13~2.00 mg/L硫化物可見光分光光度法水質 硫化物的測定 亞甲基藍分光光度法 GBT16489-19960.005 mg/L (100mL，10mm光程)＜ 0.7 mg/L容量法水質 硫化物的測定 碘量法 HJ/T60-20000.04 mg/L
氣相分子吸收法水質 硫化物的測定 氣相分子吸收光譜法 HJ/T 200-20050.005 mg/L0.020~10 mg/L 流動注射分光光度法水質 硫化物的測定 流動注射-亞甲基藍分光光度法 HJ 824-20170.004 mg/L0.016~2.00 mg/L 六價鉻可見光分光光度法水質 六價鉻的測定 二苯碳醯二肼分光光度法 GB 7467-870.2ug(30mm光程)0.004 mg/L (10mm光程)＜ 1.0 mg/L總氮紫外分光光度法水質 總氮的測定 鹼性過硫酸鉀消解紫外分光光度法 HJ 636-2012 0.05 mg/L (10mL，10mm光程) 0.20～7.00 mg/L氣相分子吸收法水質 總氮的測定 氣相分子吸收光譜法 HJ/T 199-2005 0.050 mg/L 0.200～100 mg/L連續流動分光光度法水質 總氮的測定 連續流動-鹽酸萘乙二胺分光光度法 HJ 667-20130.04 mg/L (30mm光程) 0.16～10mg/L流動注射分光光度法水質 總氮的測定 流動注射-鹽酸萘乙二胺分光光度法 HJ 668-20130.03 mg/L (10mm光程) 0.12～10mg/L石油類紫外分光光度法水質 石油類的測定 紫外分光光度法（試行）HJ 970-2018 （地表水、地下水、海水）0.01mg/L
(500mL,25mL萃取，20mm光程）0.04 mg/L（下限）紅外分光光度法水質 石油類和動植物油類的測定 紅外分光光度法 HJ 637-2018（工業廢水、生活汙水）0.04mg/L
(500mL,50mL萃取，40mm光程）0.24 mg/L（下限）