用紫外分光光度法將不可能準確定量核酸含量

2021-01-09 小胖虎的生活

因為它快速簡便、無損樣品，所以吸收光譜法早已被用於測量純的濃縮液中RNA的含量。該方法的準確度取決於幾個因素。

●RNA溶液的濃度。吸收光譜法的局限性之-是它相對不敏感，因此對大多數實驗室的分光光度計，核酸濃度至少為4μg/mL才能獲得可靠的A260另外，RNA溶液的濃度必須在分光光度計的線性範圍內；通常情況下，A260 值應落在0.1~1.0之間，此範圍以外不能進行精確測量。

如果溶液的A260為1.0，應稀釋5~10倍。如果溶液的A260為0.1,應選用更精確地測定小量RNA濃度的方法(如用微量分光光度法或基於螢光染料的方法，如下文所述)。

●RNA樣品的純度。A260 不能區分RNA和DNA，因此，建議用無RNase的DNase ：處理RNA樣品去除DNA汙染(見方案8)。

此外，汙染物如苯酚和蛋白質會影響A260的讀數；苯酚在波長為260nm處有強烈的吸收，而芳香族胺基酸的吸收在280nm處。在260nm處吸光度相對於280nm的吸光度比值(260A280)可以用來評估RNA樣品中蛋白質的汙染水平。

純的RNA的A260/A280值接近2.0。如果有明顯的蛋白質：或酚汙染，A26/A280 比小於2.0， 用紫外分光光度法將不可能準確定量核酸含量。

另一個比值A260/A230可用於評估有機化合物或高離液鹽( chaotropic salt)的汙染水平，

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